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F標(biāo)記組合物和方法及其用圖

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F標(biāo)記組合物和方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像的領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及用于 PET成像的示蹤劑以及制備所述示蹤劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于其物理和核特性,正電子發(fā)射體氟-18是用于制備標(biāo)記生物活性肽和小蛋白 質(zhì)的低分子量放射性示蹤劑和放射性藥物的理想的放射性核素。氟-18衰變具有高正電子 豐度(99%)。與碳-11、氧-15和氮-13相比,氟-18的最低正電子發(fā)射能量(最大635keV)和在 組織中的最短正電子線性范圍(2.3mm)提供了 PET成像的最高分辨率。其相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期 (109.8分鐘)使得可以進(jìn)行多步合成方法、在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)的延長(zhǎng)的成像方案、動(dòng)力學(xué)研究和 代謝產(chǎn)物分析。
[0003] 幾乎所有的現(xiàn)有技術(shù)的氟-18標(biāo)記試劑被設(shè)計(jì)為通過氨基官能團(tuán)偶聯(lián)到肽或蛋白 質(zhì)。例如,活化酯4-[18F]氟苯甲酸N-琥珀酰亞胺基酯( 18F-SFB)是最流行的用于引入輔基來(lái) 標(biāo)記肽和蛋白質(zhì)的試劑之一,這通過?;磻?yīng)實(shí)現(xiàn)(2-4)。除了 18F-SFB,18F-標(biāo)記的羧酸和 氨基試劑也是已知的。然而,它們主要用于與在所關(guān)注的生物材料中的氨基和羧酸基團(tuán)的 偶聯(lián)相結(jié)合(5-10),而不是用于PET探針設(shè)計(jì)和合成。這些現(xiàn)有技術(shù)的 18F-標(biāo)記試劑的一個(gè) 主要缺點(diǎn)是,氨基和羧基官能團(tuán)是在蛋白質(zhì)中普遍存在的,因此,沒有可能對(duì)其選擇性標(biāo) 記。
[0004] 考慮到上述情況,仍然需要一種能夠選擇性標(biāo)記所關(guān)注的蛋白質(zhì)或肽的新的標(biāo)記 方法和試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)可用作PET示蹤劑的化合物進(jìn)行放射標(biāo)記 的化學(xué)選擇性方法。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新穎的PET示蹤劑,其在PET成像中具有令人滿意的生 理特性。
[0007] 考慮本發(fā)明的目的,本領(lǐng)域熟知在大多數(shù)肽和蛋白質(zhì)中游離巰基基團(tuán)不如氨基和 羧酸一樣普遍。因此,巰基反應(yīng)性試劑已被用來(lái)在特定位點(diǎn)修飾肽和蛋白質(zhì),從而提供比羧 酸和胺反應(yīng)性試劑更高的化學(xué)選擇性的一個(gè)手段。1989年,Shiue等率先開發(fā)使用 18F-標(biāo)記 的N-取代馬來(lái)酰亞胺作為Michael受體的巰基反應(yīng)試劑。合成了N-(對(duì)18F氟苯基)馬來(lái)酰亞 胺和間馬來(lái)酰亞胺基-N-(對(duì) 18F氟芐基)苯甲酰胺(11)用于在半胱氨酸位點(diǎn)處的Fab蛋白(來(lái) 白兔IgG)標(biāo)記。在這一研究之后,報(bào)道了三種基于作為巰基選擇性試劑的 18F標(biāo)記的N-取代 馬來(lái)酰亞胺的新方法。2003年,Toyokuni等人開發(fā)了作為疏基選擇性試劑的N-[4-[(4- 18F氟 亞芐基)氨基氧]丁基]馬來(lái)酰亞胺(18F-FBABM)(12)(圖1A)。在10分鐘內(nèi)于室溫,在不優(yōu)化反 應(yīng)條件的情況下,含巰基的三肽谷胱甘肽與 18F-FBABM偶聯(lián),得到約70%的經(jīng)衰變校正的放 射化學(xué)產(chǎn)率(扣¥)。2005年,de Bruin等報(bào)道了另一種18F-馬來(lái)酰亞胺試劑l-[3-(2-(18F氟 吡啶-3-基氧基)丙基)吡咯-2,5-二酮(18F-FpyME)(圖IB)。18F-FpyME(13)通過三個(gè)連續(xù)步 驟合成,以[3-(3-Boc氨基丙氧基)吡啶-2-基]三甲基三氟甲磺酸銨為起始物??偡磻?yīng)時(shí)間 在110分鐘內(nèi),經(jīng)衰變校正的放射化學(xué)產(chǎn)率為28%至37%。該巰基反應(yīng)劑用于標(biāo)記兩種8kDa 的含巰基蛋白質(zhì),得到60 %至70 %的分離產(chǎn)率(未經(jīng)衰變校正)。2006年,Cai等合成了N-[ 2-(4-18F氟苯甲酰氨基)乙基]馬來(lái)酰亞胺(18F-FBEM)(圖1C)。通過 18F-SFB與N-(2-氨基乙基) 馬來(lái)酰亞胺偶合獲得了 18F-FBEM(14) APLC純化后,使巰基反應(yīng)劑與含巰基R⑶肽的單體和 二聚物在室溫反應(yīng)20分鐘,R⑶單體和二聚體總的經(jīng)衰變校正RCY為20±4% (n = 5)。
[0008] 盡管上述現(xiàn)有技術(shù)中的巰基反應(yīng)性標(biāo)記試劑取得了初步成功,但是多步標(biāo)記反 應(yīng)、復(fù)雜的程序和相對(duì)低的產(chǎn)率限制了這些試劑應(yīng)用。因此,現(xiàn)有技術(shù)的放射性標(biāo)記的巰基 反應(yīng)性試劑仍有許多不足之處。
[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述困難,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)明了涉及新的試劑類型的放射 標(biāo)記巰基反應(yīng)劑和用于制造該試劑的方法的新途徑。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)方面是一種18F標(biāo)記方法,其用于對(duì)存在或被引入到肽或蛋白的游離 疏基進(jìn)行位點(diǎn)特異性標(biāo)記。使用這種新方法合成了一種NTR1祀向PET成像劑,其表現(xiàn)出特定 的腫瘤攝取和優(yōu)越的腫瘤對(duì)背景的對(duì)比度。提高的腫瘤相比主要器官的攝取率(包括腫瘤/ 腎)產(chǎn)生了在注射后的較早時(shí)間點(diǎn)的高對(duì)比度圖像。在正常組織中非常低的背景應(yīng)使得可 以通過PET成像 18f-deg-vs-nt進(jìn)行非常小的腫瘤的檢測(cè)(特別是在腹部區(qū)域)。
[0011] 因此,本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一類新的能夠化學(xué)選擇性標(biāo)記靶化合物的放射性標(biāo) 記試劑。根據(jù)本發(fā)明的該方面的放射性標(biāo)記試劑通常包括乙烯基砜官能團(tuán)和放射性標(biāo)記同 位素,通式為*R-L_VS,其中*R是放射性同位素,L為連接基團(tuán),且VS代表乙烯基砜官能團(tuán)。 [0012 ] *R放射性同位素可以是任何在本領(lǐng)域中公知的合適的放射性同位素。示例性放射 性同位素可以是1工、?、8^但不限于此。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,放射性同位素是 1中。此 優(yōu)選實(shí)施方式在本文中也稱為18F乙烯基砜或18F-VS。
[0013] 該連接基團(tuán)L可以是任何具有可以容納乙烯基砜官能團(tuán)和R*放射標(biāo)記的官能部分 的合適的分子骨架。示例性連接基團(tuán)可以選自芳族、脂族、PEG、含有雜原子的連接基團(tuán),但 不限于此。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用放射性標(biāo)記來(lái)選擇性地標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽的方法。 根據(jù)本發(fā)明的這一方面的方法通常包括將如上所述的乙烯基砜放射性標(biāo)記試劑連接至靶 蛋白質(zhì)或肽的步驟。在一些實(shí)施方式中,提供或合成放射性標(biāo)記試劑的步驟可以在連接步 驟前不久進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,提供或合成步驟之前的時(shí)段受到所使用的特定*R標(biāo) 記的半衰期的限制。在放射性標(biāo)記具有較短的可用半衰期時(shí),合成和連接*R_VS標(biāo)記試劑至 靶蛋白/肽以及它們的最終應(yīng)用之間的時(shí)間間隔較短。在這種情況下,放射性基團(tuán)的連接必 須在使用標(biāo)記的蛋白質(zhì)/肽前很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生,這需要當(dāng)場(chǎng)執(zhí)行所述標(biāo)記方法的系統(tǒng)。在 其它情況下,當(dāng)*R標(biāo)記的半衰期長(zhǎng)時(shí),則靶蛋白質(zhì)/肽的標(biāo)記可以在大規(guī)模生產(chǎn)環(huán)境下非現(xiàn) 場(chǎng)進(jìn)行,將得到的標(biāo)記的蛋白質(zhì)/肽以封裝的形式遞送。
[0015] 上述適用于被乙烯基砜標(biāo)記試劑標(biāo)記的蛋白質(zhì)和肽一般包括至少一個(gè)半胱氨酸 殘基或游離硫反應(yīng)性官能團(tuán),其能夠與標(biāo)記物的乙烯基砜基團(tuán)反應(yīng)以形成穩(wěn)定的連接。在 一些實(shí)施方式中,通過一個(gè)共價(jià)硫酯鍵形成連接。在其他實(shí)施方式中,可以通過非共價(jià)連接 進(jìn)行連接。優(yōu)選地,靶蛋白質(zhì)/肽具有介于1至10個(gè)游離巰基反應(yīng)性基團(tuán)和/或半胱氨酸殘 基。更優(yōu)選地,所述靶蛋白質(zhì)/肽還具有生物功能,如酶底物或涉及某些致病途徑的結(jié)構(gòu)成 分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,靶蛋白質(zhì)/肽是神經(jīng)降壓素或其變體、或巰基化神經(jīng)降壓素 變體、其他經(jīng)穩(wěn)定化的神經(jīng)降壓素、多聚體神經(jīng)降壓素、與其他配體的雜聚體神經(jīng)降壓素。 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中,標(biāo)記放射性同位素是 18F。最優(yōu)選地,所述放射性標(biāo)記試劑是 18f-deg-vs,而所靶向的肽是神經(jīng)降壓素(即 18f-deg-vs-nt)。這種放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或 肽可以在成像技術(shù)如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)中用作示蹤劑。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及利用如上所述的本發(fā)明的新穎的示蹤劑進(jìn)行PET成像的 方法。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的方法一般包括:給受試者施用有效量的18F-VS示標(biāo)記蹤 化合物的步驟;以及使用PET成像儀器對(duì)受試者在所關(guān)注位置進(jìn)行成像的步驟。
[0018] 施用示蹤化合物的方法通常是本領(lǐng)域已知的,其可包括但不限于靜脈注射、口服 施用或其他本領(lǐng)域已知的方式。
[0019] 18F乙烯基砜至少具有下列優(yōu)于18F標(biāo)記馬來(lái)酰亞胺的優(yōu)點(diǎn):1)一步法18F-氟化前 體,以得到18F乙烯基砜;2)用乙烯基砜與巰基的反應(yīng)的產(chǎn)物得到了單一立體異構(gòu)體的結(jié)構(gòu), 這不同于會(huì)產(chǎn)生兩種可能的立體異構(gòu)體的與馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián);和3)這些乙烯基砜基團(tuán)在 溶液中是長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的,因?yàn)樗鼈冊(cè)谥行詐H不水解(15)。因此,即使在水性緩沖液條件下使 用,它們保留優(yōu)秀與含巰基的蛋白質(zhì)或其他分子偶聯(lián)的潛力。
[0020] 本發(fā)明的再一個(gè)方面是涉及通過利用上述的放射性示蹤劑對(duì)生物或生理過程進(jìn) 行成像的系統(tǒng)和裝置。圖7示出根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的系統(tǒng)/裝置的示例性示意圖。按照 本發(fā)明的這一方面的實(shí)施方式可以包括它們的傳統(tǒng)的自動(dòng)化或半自動(dòng)化盒、微波反應(yīng)器或 微流控反應(yīng)器或者它們的等同物。
[0021] 本發(fā)明的其它特征、目的以及優(yōu)點(diǎn)將通過說明書和附圖以及由所附的權(quán)利要求變 得顯而易見。
【附圖說明】
[0022]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的18F-標(biāo)記化合物的示例性合成方案和HPLC圖。 (A)F-DEG-VS的合成方案;(B)18F-DEG-VS粗反應(yīng)的的HPLC圖譜;(C)富集 18F-DEG-VS的HPLC 圖譜。
[0023] 圖2. (A)F-DEG-VS-c(RGDyC)和F-DEG-VS-c(RGDyK)的化學(xué)結(jié)構(gòu);(B)放射性-HPLC (UV)上的 19F-DEG-VS-c (RGDyC)、19F-DEG-VS-c (RGDyK)、18F-DEG-VS與c (RGDyC) /c (RGDyK) (放射)的粗反應(yīng)以及19F-DEG-VS-c (RGDyC)標(biāo)準(zhǔn)物的HPLC圖譜。
[0024] 圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的示例性放射合成方案。(A)18F-DEG-VS-NT放射合 成方案。(B) 19F-DEG-VS和NT的粗反應(yīng)的HPLC圖;(C) 18F-DEG-VS-NT (放射性)19F-DEG-VS-NT (UV)和(19F-DEG-VS) 2-NT (UV)的HPLC圖譜。
[0025] 圖4顯示了按照本發(fā)明的實(shí)施方式的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)試的示例性結(jié)果。125I-NT(8-13)和19F-DEG-VS-NT或NT (8-13)在HT-29細(xì)胞中的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)試。數(shù)據(jù)為平均值土 SE (η = 3) J軸反映了非放射性標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的濃度。19F-DEG-VS-NT和ΝΤ(8-13)的IC5Q值分別為2.03 ±0.22nmol/L 和 2.12±0.26nmol/L〇
[0026] 圖5.(A)攜帶HT-29異種移植體的小鼠在注射3.7MBq的不帶未經(jīng)放射標(biāo)記NT(8- 13)的18F-DEG-VS-NT (上圖)或帶未經(jīng)放射標(biāo)記NT (8-13)的18F-DEG-VS-NT (中圖)之后以及 在注射3.7MBq的18F-FBEM-NT(下圖)之后的代表性冠狀顯微PET圖像;(B)在攜帶HT-29異種 移植體的小鼠中在注射后(P. i .) 2小時(shí)的18F-DEG-VS-NT生物分布。
[0027] 圖6示出18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT在尿、腫瘤、腎和肝中的代謝穩(wěn)定性。 18F- DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT的保留時(shí)間分別為18.5分鐘和19.0分鐘。
[0028] 圖7示出在根據(jù)本發(fā)明的該方面的系統(tǒng)/裝置的示例性示意圖。
[0029] 圖8.18F-DEG-VS-NT于37C在1 XPBS中溫育5小時(shí)后的放射HPLC示蹤。
[0030]圖9.18F-DEG-VS-(Ac)-NT的放射合成方案和相應(yīng)的放射HPLC示蹤。
[0031 ]圖10.18F-DEG-VS-c(RGDyC)標(biāo)準(zhǔn)物和在尿中的代謝穩(wěn)定性的放射性HPLC圖譜。 [0032]圖 11 · (A)18F-FBEM的放射合成方案;(B)18F-FBEM-c(RGDyC)和 18F-FBEM-NT的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。
[0033]圖12.18F-FBEM-c(RGDyC)標(biāo)準(zhǔn)物和在尿中的代謝穩(wěn)定性的放射性HPLC圖譜。
[0034] 圖13·(A)注射18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后2小時(shí)的攜帶HT-29腫瘤的小鼠的二維 投影顯微PET圖像(箭頭表示HT29腫瘤);⑶注射 18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后的腫瘤、腎、 肝、肌肉的時(shí)間活性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 定義
[0036]除非另有定義,否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員能通常理解的相同的含義。在有矛盾的情況下,將以本文本(包括定義)為準(zhǔn)。在 此提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用以整體并入本文。本文公開 的材料、方法和實(shí)例只是說明性的,并不旨在進(jìn)行限制。
[0037] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是D或L形式的天然氨基酸殘基(例如Ala、Arg、Asn、 Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和 Val),以及具有一個(gè)或多個(gè)開放價(jià)的非天然氨基酸(例如,磷酸絲氨酸;磷酸蘇氨酸;磷酸酪 氨酸;輕脯氨酸;γ -羧基谷氨酸;馬尿酸;八氫吲哚-2-羧酸;抑胃酶氨酸;1,2,3,4-四氫 異喹啉-3-甲酸;青霉胺:鳥氨酸;瓜氨酸; α_甲基丙氨酸;對(duì)苯甲酰基苯丙氨酸;苯基甘氨 酸;炔丙基甘氨酸;肌氨酸;和叔丁基甘氨酸)殘基。該術(shù)語(yǔ)還包括攜帶有氨基保護(hù)基(例如 乙?;?、?;?、三氟乙酰基或芐氧基羰基)的天然和非天然氨基酸,以及在羧基處被保護(hù)基 團(tuán)保護(hù)(例如,保護(hù)為(Q-C6)烷基酯或酰胺、苯基酯或酰胺或者芐基酯或酰胺)的天然和非 天然氨基酸。其他合適的氨基和羧基保護(hù)基團(tuán)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如,參見T.W. Greene^Protecting Groups In Organic Synthesis;Wiley:New York,1981;D·Voet, Biochemistry?ffiley:New York?1990;L Stryer^Biochemistry?(3rd Ed.)?ff H.Freeman and Co:New York,1975;J.March,Advanced Organic Chemistry,Reactions,Mechanisms and Structure,(2nd Ed·),McGraw Hi 11:New York,1977;F·
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