有較好的序列耐 受性且可能適用于更長(zhǎng)的多肽。
[0139] 圖 16、圖 17 為該多肽純化后 HPLC(Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-15%，30min-40%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 結(jié)果，可找到對(duì)應(yīng)分子量m/z = 1068. 5439 [M+H]。
[0140] 實(shí)施例6:
[0141] 末端甲基化L型酒石酸修飾多肽（cyclo-1,4)-[L_tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]_NH 2 的合成，即結(jié)構(gòu)式（VID )的合成：
[0142]
[0143] 實(shí)施例1中手性二酸換為甲基化的L型酒石酸。實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，步驟 (5)直接可以得到產(chǎn)物，無(wú)需進(jìn)行步驟(6)。經(jīng)過(guò)高效液相色譜純化可得到終產(chǎn)物，產(chǎn)物在 H20(25°C )中螺旋性提高，呈31Q螺旋（圖18,表6)。
[0144] 表6多肽VID在25°C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0145]
[0146] 多肽31(]螺旋是較α螺旋松散的一種螺旋結(jié)構(gòu)，可用圓二色譜表征，其特征為 190nm處為正峰，同時(shí)218nm(長(zhǎng)肽負(fù)峰位于222nm，短肽負(fù)峰會(huì)發(fā)生位移）、208nm為負(fù)峰且 θ 218/ Θ 2。8比例越接近〇. 5其螺旋含量越高，而上述結(jié)果說(shuō)明末端側(cè)鏈-尾鏈連接酒石酸結(jié) 合Dab修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Dab由于比Dap多一個(gè)碳原子，使得穩(wěn)定成為較 α螺旋松散的31(]螺旋結(jié)構(gòu)。
[0147] 圖 19、圖 20 為該多肽純化后 HPLC(Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-10%，30min-30%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 結(jié)果，可找到對(duì)應(yīng)分子量m/z = 544. 2735 [M+H]。
[0148] 實(shí)施例7 :
[0149] 末端 D 型天冬氨酸修飾長(zhǎng)肽 SRC_lBox2PERM L-TCDa H-(cycl〇-2,5)_[ArgisoAsp IleLeuDapArg LeuLeuGln]_NH2 的合成，即結(jié)構(gòu)式（IX )的合成：
[0150]
[0151] 實(shí)施例1中序列換為經(jīng)改進(jìn)的SRC-lBox2。實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，步驟（5)后 無(wú)需進(jìn)行步驟(6)，而是修飾上一個(gè)精氨酸，此例證明了末端修飾的可變性。經(jīng)過(guò)高效液相 色譜純化可得到終產(chǎn)物，經(jīng)穩(wěn)定的多肽在H 20(25°C)中呈現(xiàn)特征的α螺旋（圖21，表7)。
[0152] 表7多肽IX在25°C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0153]
[0154] 多肽α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時(shí)222nm、 208nm為負(fù)峰且θ 222/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋含量越高，而上述結(jié)果說(shuō)明末端側(cè)鏈-尾 鏈連接天冬氨酸修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且該方法具有較好的序 列耐受性且可能適用于更長(zhǎng)的多肽。在多肽上修飾FITC(SRC-lBox2PERML-T⑶bFIT C-(cyclo_3,6)-[i3AlaArgisoAspIle LeuDapArgLeuLeuGln]_NH2)，與 Hela 細(xì)胞孵育 (5yM，37°C，4hr，Leica CTR7000)發(fā)現(xiàn)該多肽具有良好的穿透細(xì)胞膜的能力，而相對(duì)應(yīng)的 野生型的線性多膚（SRC_lBox2wtb FITC-PAlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln_NH2)不具 備穿膜能力。上述結(jié)果說(shuō)明該方法可以賦予多肽穿透細(xì)胞膜的能力。
[0155] 圖23、圖24、圖25、圖26、圖27、圖28為所涉及多肽純化后HPLC (Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm,乙臆 / 水：0min_2%，5min_15%，30min_50% ) 及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)結(jié)果，可找到對(duì)應(yīng)分子量 SRC-lBox2PERM L-TCDa : m/z = 547.3513[M+2H]， SRC-lBox2PERM L-TCDb :777.3887[M+2H]，SRC-lBox2wtb: 808. 9271 [M+2H]。圖22為所涉及FITC修飾的所涉及多肽的細(xì)胞成像圖。
[0156] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制， 應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干 改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不 脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、 修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述 實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其結(jié)構(gòu)式如式（I )所 示：其中，R為任意氨基酸殘基，η為1~2的正整數(shù)，Ri、R2連接的碳原子至少一個(gè)為手性 碳原子，且Ri、R2各自獨(dú)立地選自氨、烷基、氨基或其衍生物取代基和居基或其衍生物取代 基中的一種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述手性二酸選自酒石酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和天冬氨酸或其衍生物 中的一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述手性二酸為L(zhǎng)型酒石酸或其衍生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述手性二酸為手性中必位于N端目位的己醜化天冬氨酸或其衍生物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述多膚的長(zhǎng)度大于或等于5個(gè)氨基酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述R為L(zhǎng)型氨基酸或者D型氨基酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述R為α氨基酸或目氨基酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物，其特 征在于，所述η為1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8任一權(quán)利要求所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的 多膚化合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 固相合成末端含手性二酸，倒數(shù)第Η位含賴(lài)氨酸類(lèi)似物的多膚，同時(shí)脫去駿基和氨基 保護(hù)基，關(guān)環(huán)得到含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物的合 成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1)含有手性二酸的多膚的固相合成，固相合成得到的多膚化合物，其結(jié)構(gòu)式如式 (II )所示：(2) 用鉛催化劑同時(shí)脫去二酸保護(hù)基和氨基保護(hù)基； (3) 在六氣磯酸苯并Η哇-1-基-氧基Η化咯烷基磯/1-居基苯并Η哇條件下分子內(nèi) 醜胺基關(guān)環(huán)，獲得多膚； (4) 將步驟（3)所得的多膚從固相切下，經(jīng)分離純化獲得含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性 二酸修飾的多膚化合物（I )，通過(guò)圓二色譜表征方法驗(yàn)證含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二 酸修飾的多膚化合物的螺旋性； 其中，所述步驟（2)至步驟（3)的合成路線為：11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物的合 成方法，其特征在于，當(dāng)R2為巧甲氧撰醜保護(hù)的氨基時(shí)，需要脫除巧甲氧撰醜，然后保留氨 基，醜化或烷基化或連接生物素或連接英光基團(tuán)，其合成路線為：12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多膚化合物的合 成方法在穩(wěn)定多膚α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物及其合成方法，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：本發(fā)明的多肽的合成方法包括如下步驟：(1)含有手性二酸的多肽的固相合成；(2)用鈀催化劑同時(shí)脫去二酸保護(hù)基Allyl(烯丙基)和氨基保護(hù)基Alloc(烯丙氧羰基)；(3)在六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羥基苯并三唑條件下分子內(nèi)酰胺基關(guān)環(huán)，獲得多肽；(4)將步驟(3)的多肽從固相切下，經(jīng)分離純化獲得含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾多肽，并通過(guò)圓二色譜等方法評(píng)價(jià)驗(yàn)證多肽的螺旋性，用熒光顯微鏡成像評(píng)價(jià)多肽的穿膜性。本發(fā)明的多肽及其合成方法成本低、簡(jiǎn)單高效，對(duì)于穩(wěn)定多肽α-螺旋，提高其成藥性有重要意義。
【IPC分類(lèi)】C07K7/56, C07K1/04, C07K7/06, C07K1/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105566456
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410528075
【發(fā)明人】李子剛, 趙輝
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)深圳研究生院
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年10月9日