acidAlaAlaDabAlaAla]_NH2 純化 后HPLC圖。
[0052] 圖 20 為實(shí)施例 6 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]_NH2 質(zhì)譜 圖。
[0053] 圖 21 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC_lBox2PERM L-TCDa H-(cycl〇-2, 5)
[0054] -[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gln]_NH2 在 H20 中 CD 圖。
[0055] 圖 22 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC-lBox2wtb FITC-β AlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln_NH2與長(zhǎng)膚 SRC_lBox2wtb FITC-PAlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln_NH2 細(xì)胞成像圖，其中（a)為 SRC-lBox2PERM L-TCDb FITC 通道成像；（b)為 SRC-lBox2PERM L-TCDb DAPI 通道成像；（c)為 SRC-lBox2PERM L-TCDb 明場(chǎng)成像；（d)為 SRC-lBox2PERM L-TCDb FITC，DAPI，明場(chǎng)成像疊加；（e)為長(zhǎng)肽SRC-lBox2wtb FITC通道成像；（f)為 SRC-lBox2wtb DAPI 通道成像；（g)為 SRC-lBox2wtb 明場(chǎng)成像；（h)為 SRC-lBox2wtb FITC， DAPI，明場(chǎng)成像疊加。
[0056] 圖 23 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC_lBox2PERM L-TCDa H-(cycl〇-2, 5)
[0057] -[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gin]-NH2 純化后 HPLC 圖。
[0058] 圖 24 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC_lBox2PERM L-TCDa H-(cycl〇-2, 5)
[0059] -[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gin]-NH2 質(zhì)譜圖。
[0060] 圖 25 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC-lBox2PERM L-TCDb FITC-(cycl〇-3, 6)-[ β AlaArgi soAspIleLeuDapArgLeuLeuGln]_NH2 純化后 HPLC 圖。
[0061] 圖 26 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC-lBox2PERM L-TCDb FITC-(cycl〇-3, 6)-[β AlaArgi soAspIleLeuDapArgLeuLeuGln] -ΝΗ2 質(zhì)譜圖。
[0062] 圖 27 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC-lBox2wtb FITC-β AlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln-NH2 純化后 HPLC 圖。
[0063] 圖 28 為實(shí)施例 7 中長(zhǎng)肽 SRC-lBox2wtb FITC-β AlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln_NH2 質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0064] 以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域內(nèi)研究者或技術(shù)人員可 根據(jù)本說(shuō)明書所述內(nèi)容明確本發(fā)明的特點(diǎn)。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的【具體實(shí)施方式】加 以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的 精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0065] 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：α -螺旋大約占蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的近30%，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)與 其它生物分子的識(shí)別過(guò)程中起關(guān)鍵作用。雖然短肽特別是α-螺旋在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有很 大的應(yīng)用前景，但是短肽因?yàn)槠錁O差的穩(wěn)定性，較差的進(jìn)入細(xì)胞的能力和較差的靶點(diǎn)親和 力難以被直接開(kāi)發(fā)。
[0066] 構(gòu)象穩(wěn)定是解決α -螺旋成藥性問(wèn)題的一種重要策略，通過(guò)化學(xué)修飾固定多肽構(gòu) 象不僅可以提高其抵抗水解的能力，還可通過(guò)形成分子內(nèi)氫鍵提高多肽疏水性以改善穿膜 性，克服熵罰以提高與靶點(diǎn)親和力。
[0067] 穩(wěn)定螺旋的方法包括利用各種化學(xué)（二硫鍵、酰胺鍵、烯烴復(fù)分解等）共價(jià)或者非 共價(jià)連接側(cè)鏈，或者利用末端修飾成核誘導(dǎo)螺旋。上述穩(wěn)定方法各有不同程度的缺陷。除 了一些方法（離子鍵、二硫鍵）在穩(wěn)定性上的缺陷，側(cè)鏈-側(cè)鏈連接對(duì)多肽與靶點(diǎn)結(jié)合的影 響難以預(yù)測(cè)，導(dǎo)致篩選成本增加。基于末端修飾成核誘導(dǎo)螺旋的氫鍵替代策略需要較為繁 瑣的氮烷基化模塊的構(gòu)建。
[0068] 本發(fā)明從五肽模型肽出發(fā)，構(gòu)建了末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽，該 策略顯著提高了單螺旋多肽α -螺旋，提高了多肽的穩(wěn)定性，同時(shí)探索了該方法的序列耐 受性。
[0069] 本發(fā)明用高效液相色譜對(duì)多肽進(jìn)行分離純化，通過(guò)圓二色譜等表征方法評(píng)價(jià)確證 了本策略對(duì)于五肽α -螺旋含量的提高，同時(shí)提高多肽的穩(wěn)定性。
[0070] 本發(fā)明的含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽，其結(jié)構(gòu)通式如式（I ) 所示：
[0071]
[0072] 其中，R為任意氨基酸殘基，η為1~2的正整數(shù)，&、R2連接的碳原子至少一個(gè)為 手性碳原子，且氏、R 2各自獨(dú)立地選自氫、烷基、氨基或其衍生物取代基和羥基或其衍生物 取代基中的一種。
[0073] 當(dāng)η優(yōu)選為1時(shí)，對(duì)螺旋性有更顯著的提升。
[0074] 制備上述的穩(wěn)定多肽的核心反應(yīng)步驟如下：
[0075]
[0076] 高效液相色譜純化得到的多肽溶于水/乙腈，用圓二色譜確定其構(gòu)象。多肽在水 中呈現(xiàn)穩(wěn)定的α-螺旋。
[0077] 本發(fā)明可很好的穩(wěn)定多肽螺旋，并提高多肽穩(wěn)定性，序列耐受性好。多肽的合成完 全在固相上進(jìn)行，合成過(guò)程中無(wú)需非天然氨基酸，與氫鍵替代策略相比沒(méi)有構(gòu)建較為繁瑣 的氮烷基化模塊，成本低。與側(cè)鏈-側(cè)鏈連接策略相比，僅消耗一個(gè)氨基酸殘基，尾環(huán)親水， 其引入對(duì)多肽結(jié)合的影響更具可預(yù)測(cè)性。當(dāng)手性二酸為天冬氨酸時(shí)本方法末端相對(duì)于氫鍵 替代策略有一個(gè)氨基，可根據(jù)需要進(jìn)行各種修飾。
[0078] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0079] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0080] 實(shí)施例1 :
[0081] 末端 D 型天冬氨酸修飾多膚 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2 的合成，即結(jié)構(gòu)式（III)的合成：
[0082]
[0083] 具體路線如下所示：
[0084]
[0085] 具體操作步驟為：
[0086] (1)多肽固相合成：稱取lOOmg Rink amide MBHA樹(shù)脂于10ml接肽管中，加入 lml N-甲基吡咯烷酮（NMP)，鼓氮?dú)馊苊洏?shù)脂30min，加入50% (v/v)嗎啡啉的NMP溶液 (v代表體積），鼓氮?dú)?0min，NMPX5,二氯甲烷（DCM) X5交替洗共計(jì)10遍樹(shù)脂。將配好 的Fmoc-Ala-OH(5eq，0. 4M，NMP)溶液、6-氯苯并三氮唑-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HCTU) (0· 38M，NMP)溶液、N，N-二異丙基乙胺（DIPEA)按 7. 5:7. 5:1 (v:v:v)混勻后加入樹(shù) 脂中鼓氮?dú)鈒h ;抽掉反應(yīng)液，按上述方法洗樹(shù)脂后進(jìn)行下一步操作。
[0087] (2)第二至第五個(gè)氨基酸與上述連接方法相同，即將配制好的 Fmoc-Ala-OH(5eq，0. 4M，NMP)溶液、6-氯苯并三氮唑-1，1，3,3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HCTU) (0· 38M，NMP)溶液、N，N-二異丙基乙胺（DIPEA)按 7. 5:7. 5:1 (v:v:v)混勻后加入樹(shù) 脂中鼓氮?dú)鈒h ;抽掉反應(yīng)液，按上述方法洗樹(shù)脂后進(jìn)行下一步操作。特別的，第三個(gè)氨基酸 推薦偶聯(lián)時(shí)間為1. 5h。
[0088] (3)烯丙基保護(hù)的天冬氨酸：50% (v/v)嗎啡啉NMP溶液脫保護(hù)，按上述方法洗樹(shù) 月旨。Fmoc-Asp(0H)-0Allyl，1-羥基苯并三唑（H0Bt(l-羥基苯并三唑）），N，N-二異丙基碳 二亞胺（DIC)(均為 4eq)混合（Fmoc-Asp(OH)-OAllyl 終濃度為 0· 2M，NMP)5min 后加入樹(shù) 脂中鼓氮?dú)?-3h，抽掉反應(yīng)液進(jìn)行下一步反應(yīng)。
[0089] (4)鈀催化脫保護(hù)：二甲基巴比妥酸（4eq)與樹(shù)脂在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入四三苯基膦 鈀溶液（leq，1.5ml DCM)，避光攪拌2h，抽掉反應(yīng)液重復(fù)反應(yīng)一次。反應(yīng)完畢用二乙基二硫 代氨基甲酸鈉（〇. 5%，DMF)溶液洗5遍，后用上述常規(guī)方法洗10遍。
[0090] (5)分子內(nèi)酰胺鍵關(guān)環(huán)：PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷） (3. 2eq)，H0Bt(3. 2eq)，N-甲基嗎啡啉（NMM，3. 2eq)溶于lmlNMP后加入樹(shù)脂，