一種分離純化還原型谷胱甘肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物分離純化領(lǐng)域，具體而言，涉及一種分離純化還原型谷胱甘肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽(Glutath1ne，GSH)是一種重要的調(diào)節(jié)生理功能的藥物，在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣，已成為醫(yī)學(xué)上重要的具有調(diào)節(jié)人體免疫功能和輔助抗癌功能的藥物之一。GSH的抗氧化性又使它在食品工業(yè)中的應(yīng)用備受人們關(guān)注。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的一種含γ -谷氨酰基和巰基的生物活性三肽類化合物，在蛋白質(zhì)和DNA的合成、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的保護(hù)等重要的生物功能中起著直接或間接的作用。它主要分布于動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞中，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)保健、食品加工等很多領(lǐng)域。
[0003]谷胱甘肽的相對(duì)分子質(zhì)量為307.33，熔點(diǎn)為189-193°C，其晶體呈無(wú)色透明細(xì)長(zhǎng)柱狀，等電點(diǎn)為5.93。它溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固體相對(duì)較穩(wěn)定，而水溶液在空氣中易被氧化。兩分子還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基氧化縮合為二硫鍵即可得到氧化型谷胱甘肽(GSSG)。
[0004]谷胱甘肽的生產(chǎn)目前主要有酶法和酵母發(fā)酵法兩種，不管是哪種方法生產(chǎn)的谷胱甘肽，粗提液中均含有很多雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、多肽、氨基酸、鹽類等等，而谷胱甘肽在水溶液中的穩(wěn)定性不好，易氧化和降解，這給分離純化帶來(lái)了很大的困難，因此高純度、高收率、環(huán)保低能耗的谷胱甘肽工業(yè)化分離比較困難。
[0005]目前，有報(bào)道的分離純化谷胱甘肽的方法有以下幾種:銅鹽法、離子交換法、電滲析法、瓊脂糖凝膠過(guò)濾法、雙水相結(jié)合溫度誘導(dǎo)相分離法及金屬汞親和層析法，其中有工業(yè)前景的是:銅鹽法和離子交換法。
[0006]I)銅鹽法:氧化亞銅能與巰基特異性結(jié)合，從而將GSH從水相結(jié)合到固相，方便對(duì)GSH與大部分雜質(zhì)的分離。但是銅鹽法有很大的局限性。首先，固相的銅鹽需要用硫化氫還原以釋放GSH，而硫化氫的氣味重、有毒，會(huì)導(dǎo)致較高的污染;其次，溶液中含有巰基的雜質(zhì)也較多，銅鹽法難以將它們與GSH分離，而其中有些雜質(zhì)結(jié)晶去除困難，這便導(dǎo)致了GSH最終成品的純度不尚，某些雜質(zhì)超標(biāo)。
[0007]2)離子交換法:離子交換法又分為陽(yáng)離子交換和陰離子交換兩種，目前均有報(bào)道，如中國(guó)專利申請(qǐng)CN200810233835.6中提供了一種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化方法；中國(guó)專利申請(qǐng)CN201210111271.5中提供了一種陰離子交換樹(shù)脂分離純化的方法。離子交換法具有操作便捷、低污染的特性，但同樣有其缺點(diǎn)。首先，GSH在水溶液中穩(wěn)定性差，離子交換的過(guò)程中容易出現(xiàn)降解和氧化的現(xiàn)象，所以需要在密閉環(huán)境同時(shí)進(jìn)行低溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)才能保持GSH不降解和氧化;其次，離子交換法對(duì)某些與GSH性質(zhì)相似的雜質(zhì)無(wú)法去除，即使結(jié)合了吸附樹(shù)脂也會(huì)因?yàn)槟承╇s質(zhì)與GSH極性差異小而導(dǎo)致難以分開(kāi)，最終成品的雜質(zhì)非常容易超標(biāo)。
[0008]因此，工業(yè)上仍需要研究和開(kāi)發(fā)更好的分離純化谷胱甘肽的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]鑒于現(xiàn)有提取工藝存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種從含有谷胱甘肽的溶液中分離純化還原型谷胱甘肽的新方法，所述方法環(huán)保且獲得的谷胱甘肽純度較高。
[0010]具體而言，本發(fā)明提供的一種從含有谷胱甘肽的溶液中分離純化還原型谷胱甘肽的方法包括以下步驟:
[0011]I)向谷胱甘肽(GSH)溶液中加入氧化劑，使其氧化至氧化型谷胱甘肽(GSSG);
[0012]2)向溶液中加入酸，調(diào)節(jié)pH至1.0-4.0，離心或過(guò)濾；
[0013]3)將步驟2)得到的離心或過(guò)濾后的溶液分別經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂、吸附樹(shù)脂處理，得到GSSG洗脫液；
[0014]4)將步驟3)得到的洗脫液使用還原劑進(jìn)行還原得到GSH溶液，將還原得到的GSH溶液用吸附樹(shù)脂脫鹽，之后濃縮、結(jié)晶、干燥，得到GSH。
[0015]本發(fā)明所述的谷胱甘肽溶液可以使用本領(lǐng)域用于制備谷胱甘肽的常規(guī)方法制備得到，包括酵母發(fā)酵抽提液(其制備方法參考中國(guó)專利申請(qǐng)CN201310644859.1)或酶法轉(zhuǎn)化液(其制備方法參考中國(guó)專利申請(qǐng)CN201310538982.5)等。值得注意的是，上述參考文獻(xiàn)的全文以合并引用的方式并入本文。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟I)的氧化劑的加入量為1.5g/L_7g/L，更優(yōu)選3-5g/Lo
[0017]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟I)中的氧化劑為無(wú)機(jī)氧化劑，優(yōu)選選自氧氣、氯酸鉀、溴酸鉀、碘酸鉀、次氯酸鈉、次溴酸鈉、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等，更優(yōu)選氯酸鉀或溴酸鉀。
[0018]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟2)中調(diào)節(jié)pH至2.5-3.5。所述pH的調(diào)節(jié)使蛋白質(zhì)變性沉淀。
[0019]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟2)的調(diào)節(jié)pH所用的酸包括鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸，更優(yōu)選鹽酸或硫酸。
[0020]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟3)中，將步驟2)得到的溶液經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂的處理過(guò)程為:用0.02-0.05mol/L的弱酸洗滌2-6倍柱體積，優(yōu)選的弱酸濃度0.03mol/L，優(yōu)選的洗滌柱體積為5倍，再用1-5%，優(yōu)選5%的強(qiáng)酸洗脫6-12倍柱體積，優(yōu)選8倍柱體積。
[0021]優(yōu)選地，所述弱酸為甲酸或乙酸，更優(yōu)選乙酸;優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸為磷酸、硝酸、鹽酸或硫酸，更優(yōu)選硫酸。
[0022]所述步驟3)中所述離子交換樹(shù)脂包括強(qiáng)酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、弱酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、強(qiáng)堿型的陰離子交換樹(shù)脂、弱堿型的陰離子交換樹(shù)脂。
[0023]所述強(qiáng)酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為HD-8，苯乙烯系，粒度范圍(mm):0.315-1.25>95%，質(zhì)量全交換容量(mmol/g): > 4.0;例如，可購(gòu)自上海華震科技有限公司；
[0024]所述弱酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為D152，苯乙烯系，粒度范圍(mm):0.315-1.25>90%,質(zhì)量全交換容量(mmol/g): 2 8.0;例如，可購(gòu)自上海華震科技有限公司；
[0025]所述強(qiáng)堿型的陰離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為D201，苯乙烯系，粒度范圍(mm):0.315-1.2>95%,質(zhì)量全交換容量(mmol/g): 2 3.5;例如，可購(gòu)自上海華震科技有限公司；
[0026]所述弱堿型的陰離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為WA30，苯乙烯系，離子交換容量(meq/mL):〉1.5，粒度范圍(mm):0.3-1.18 2 94%;例如，可購(gòu)自三菱化學(xué)。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟3)中，將步驟2)得到的溶液經(jīng)過(guò)吸附樹(shù)脂的處理過(guò)程為:將從離子交換樹(shù)脂層析柱洗脫的GSSG溶液上柱吸附樹(shù)脂層析柱，用去離子水洗脫，收集其中GSSG含量>0.2g/L的部分。
[0028]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟4)的還原劑是金屬粉，優(yōu)選鋅粉或鐵粉。在還原的過(guò)程中同時(shí)滴加一定量的稀酸。
[0029]進(jìn)一步優(yōu)選地，加入的還原劑的量為GSSG摩爾量的3-5倍，優(yōu)選3倍，稀酸濃度為
0.5-211101/1，優(yōu)選111101/1，稀酸的添加量為還原劑摩爾量的1.5-2倍，優(yōu)選2倍。
[0030]所述稀酸為磷酸、硝酸、鹽酸或硫酸，優(yōu)選為鹽酸或硫酸。
[0031]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟3)和步驟4)中所述吸附樹(shù)脂可以采用非極性的吸附樹(shù)脂SP207(芳香族系衍生型，離子交換容量(meq/mL):>1.5，粒度范圍(mm): 20.25mm >90%，例如可購(gòu)自三菱化學(xué))、D3520(粒度范圍(mm):0.3-1.2