一種蒲公英籽抗氧化肽及其制備方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蒲公英籽抗氧化肽及其制備方法與應用，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗氧化劑在食品和人體內(nèi)的氧化過程中起著至關(guān)重要的作用。在食品中，抗氧化 劑可以有效地延緩脂質(zhì)過氧化物的形成、減少蛋白質(zhì)的氧化以及導致蛋白質(zhì)功能改變的脂 源性羰基與蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此可以使食品在貯藏過程中保持原有的質(zhì)地、風味、 色澤和營養(yǎng)。在人體中，抗氧化劑可以保護組織和器官不被活性氧自由基損傷。合成抗氧化 劑具有很好的清除自由基的功能，但BHT、PG等合成抗氧化劑對于人體的酶系統(tǒng)有一定的毒 性作用，而天然抗氧化劑同時兼?zhèn)漭^強的抗氧化活性和很高的安全性，因此人們逐步將研 究重點轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。
[0003] 食源性抗氧化肽被認為是低分子量、低成本、高活性和易于吸收的健康安全的化 合物。目前獲得抗氧化肽的方法主要有三種:從天然植物體和動植物組織器官中提取、人工 合成和水解法。其中，酶水解法選擇合適的蛋白酶水解各種蛋白質(zhì)生產(chǎn)生物活性肽，具有生 產(chǎn)量大、原料來源廣、成本低、生產(chǎn)條件溫和、安全性高以及活性高的優(yōu)點。
[0004] 蒲公英籽是菊科多年草本生植物蒲公英(Taraxacum mongolicum)成熟干燥的種 子。蒲公英是一味常見的清熱解毒類中草藥，別名婆婆丁、黃花地丁和奶汁草等，生長地區(qū) 主要分布在北半球，在我國大部分地區(qū)也均有分布。蒲公英作為藥用植物的研究歷史已有 數(shù)千年，《千金方》、《本草綱目》等中記載蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效， 而現(xiàn)代研究表明，蒲公英具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保肝利膽、抗胃損傷的作用。蒲公 英還可供食用，是營養(yǎng)價值很高的野生蔬菜。蒲公英含有豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白含量為 18.8%，可作為潛在的食用蛋白來源。在我國大部分地區(qū)均有栽種蒲公英，因此產(chǎn)量豐富，且 其含有一些具有重要的生物活性的化學成分，具有極高的研究價值和開發(fā)前景。目前，國內(nèi) 外對蒲公英全草的研究較多，而且主要研究蒲公英黃酮、多糖以及萜類化合物，而對蒲公英 籽的蛋白及多肽的研究很少。多肽的分離純化和功能研究對于植物的綜合開發(fā)、科學研究 以及食品、藥物等領(lǐng)域應用中均具有重要作用。因此，有必要對其進行深入系統(tǒng)研究，對于 蒲公英籽的綜合開發(fā)和利用提供重要的科學依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抗氧化活性強的蒲公英籽抗氧化肽，并且可以將該抗氧 化肽應用于食品添加劑的研制與開發(fā)。
[0006] 本發(fā)明的一種抗氧化肽，其氨基酸序列為Val-Phe。用單字母表示為VF，即由纈氨 酸-苯丙氨酸2個氨基酸殘基構(gòu)成。
[0007] 所述抗氧化肽分離純化方法，具體步驟包括如下： 1)酶解物的制備：蒲公英籽蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解，酶解條件為酶解時間4.90h、pH 8.5、酶底比7.80%、底物濃度為2%; 2)分離純化:取蒲公英籽酶解物利用Sephadex G-25凝膠色譜進行分離，以去離子水為 洗脫液，流速〇. 3 mL/min，測量洗脫組分214 nm波長處的吸光值，并測定各吸收峰對應的洗 脫組分的DPPH自由基清除活力，收集活性較高的峰，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一 步分離;RP-HPLC的洗脫梯度為0~60 min，體積分數(shù)為5%~55% V/V乙腈;流速為2.0 mL/min， 檢測波長214 nm，收集體積分數(shù)為30% V/V乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗氧化二 肽。
[0008] 所述抗氧化肽具有強活性，對DPPH，超氧陰離子、ABTS自由基和羥基自由基都有強 的清除作用，表明其在抗氧化活性開發(fā)和應用方面有重要價值。蒲公英籽天然抗氧化肽對 DPPH自由基、ABTS自由基都具有較強的清除活力，EC5Q值（自由基清除率達到50%時的多肽濃 度)分別為〇.98mg/mL，0.099mg/mL，羥基自由基和超氧陰離子自由基也具有一定的清除能 力。
【附圖說明】
[0009] 圖1:蒲公英籽酶解物Sephedex G-25凝膠過濾色譜圖。
[0010]圖2:凝膠色譜洗脫峰4反相高效液相色譜圖。
[0011] 圖3:蒲公英籽抗氧化肽的質(zhì)譜圖。
[0012] 圖4:蒲公英籽抗氧化肽對DPPH自由基清除作用。
[0013] 圖5:蒲公英籽抗氧化肽對ABTS自由基清除作用。
[0014] 圖6:蒲公英籽抗氧化肽的羥基自由基清除作用。
[0015] 圖7:蒲公英籽抗氧化肽對超氧陰離子自由基清除作用。
【具體實施方式】
[0016] 本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過 程，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于下述的實施實例。
[00Π ] 實施例1 本發(fā)明所述抗氧化肽的制備方法如下： 蒲公英籽蛋白的提取:蒲公英籽經(jīng)高速中藥粉碎機粉碎，用〇. lmol/L的NaOH溶液浸提， 在40 °C下攪拌140min，10000 rpm離心20min，取其上清液，用lmol/L鹽酸調(diào)其pH值為4.0， 12000 rpm離心20min，取其沉淀冷凍干燥，得到蒲公英籽蛋白粉。
[0018] 蒲公英籽蛋白的酶解:采用堿性蛋白酶酶解蒲公英籽蛋白，蛋白濃度為2%(w/v)， 酶底比為7.8%，酶解時間4.90h，pH 8.5，溫度為45°C，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶lOmin，然后迅 速冷卻至室溫，10000 rpm離心20min，收集上清液冷凍干燥備用。
[0019] Sephadex G-25凝膠過濾色譜:按上述方法獲得蒲公英籽蛋白酶解物凍干粉，溶解 于去離子水中，12000 rpm離心15 min。取上清液用0.22 μπι孔徑微濾膜過濾。Sephadex G-25凝膠柱（1.6cmX 100 cm)用去離子水平衡，將已過濾的樣品上柱。用去離子水洗脫，流速 0.3 mL/min，于214 nm波長處檢測洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線，如圖1所示。收集洗脫峰峰 4,冷凍干燥，-80 °C低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 高效液相色譜:去離子水溶解上述峰4凍干粉，采用RP-HPLC進一步分離。液相色譜 系統(tǒng)為LC-15A，裝配Gemini 5μ C18(250mmX 10mm)反相柱（Phenomenex，UK)，用水和乙臆 (含體積分數(shù)為〇.〇5%(V/V)的三氟乙酸）構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫。洗脫梯度：0~60 min，體積分數(shù)為5%~55%(V/V)乙腈;洗脫流速2.0 mL/min，檢測波長214 nm，洗脫曲線如圖2 所示。收集體積分數(shù)為30%(V/V)乙腈濃度的洗脫峰VF-2(保留時間為31.5~33. lmin)，冷凍 干燥即為本發(fā)明所述抗氧化肽。
[0021]將收集到的抗氧化肽冷凍干燥，采用高效液相色譜檢驗所得到的組分純度。經(jīng)檢 測，該抗氧化肽組分純度達到95%，可測定其氨基酸序列。
[0022]用液相色譜與質(zhì)譜連用（LC-MS/MS)方法測定氨基酸序列（圖3)，得到該抗氧化肽 的氨基酸序列VF。
[0023] 實施例2 對實施例1中得到的天然抗氧化肽活性進行研究： DPPH自由基清除活力：取不同濃度樣品lmL與DPPH溶液(0.1 mM，95%乙醇配制）lmL充分 混勻，室溫避光靜置30min，517nm測定吸光值；用lmL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液為樣品參 比組;空白組為lmL DPPH溶液與lmL 95%乙醇溶液。樣品的DPPH自由基清除活力根據(jù)下列公 式(1)進行計算：
式中一樣品組吸光值;心一樣品參比組吸光值;A〇-空白組吸光值 ABTS自由基清除活力：配制7mM的ABTS貯存母液及2.45mM的過硫酸鉀溶液，臨用前以1: 1的比例混合，室溫放置16h后，用磷酸鹽緩沖液(5mM、pH7.4)稀釋至734nm處吸光值為0.70 ± 0.0 2，即A B T S自由基溶液。A B T S自由基溶液與不同濃度的樣品等體積混合，室溫反應 lOmin后，于734nm下測定吸光值，磷酸鹽緩沖液(5mM、pH7.4)調(diào)零。空白組用蒸餾水代替樣 品。樣品的ABTS自由基清除活力按下列公式（2)進行計算：
式中:Acontrol-空白組吸光值;Asample-樣品組吸光值 羥基自由基清除活性：lmL樣品與0.3mL FeS〇4(8mM)、lmL水楊酸（3mM)及0.25mL H2O2 (20mM)混勻，37 °C保溫30min，流水冷卻后，加入0.45mL蒸餾水使反應液總體積達3mL，3000g 離心10min，于510nm波長下測定上清液吸光值，蒸餾水代替樣品作為空白對照。樣品的羥基 自由基清除活力桉下列公式（3)講行計筧：
式中:Acontrol-空白組吸光值;Asample-樣品組吸光值 超氧陰離子清除能力:取〇. 1 mL樣品溶液加入0. lmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2) 2.8mL，以蒸餾水代替樣品做為空白對照管。震蕩混勻，25°C水浴中保溫lOmin后加入3mmol/ L的鄰苯三酚溶液0.1mL(25°C水浴預熱），迅速混勻并開始計時，每隔30s在325nm處測定吸 光度值A(chǔ)325，3min后結(jié)束。以去離子水0.2mL加入Tris-HCl緩沖溶液2.8mL調(diào)零。作吸光值隨 時間變化的回歸方程，曲線斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，樣品對超氧陰離子的清除率計算 公式為：
式中，ΔΑο/min:空白對照組吸光值曲線斜率；AAs/min:樣品組吸光值曲線斜率。
[0024]經(jīng)本實施例測定，蒲公英籽天然抗氧化肽對DPPH自由基、ABTS自由基都具有較強 的清除活力，EC5Q值（自由基清除率達到50%時的多肽濃度）分別為0.98mg/mL，0 · 099mg/mL (圖4,圖5)，羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力較弱，其EC5Q值均大于2mg(圖6,圖7)。 [0025]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種蒲公英籽抗氧化二肽，其特征在于:所述抗氧化二肽氨基酸序列為Val-Phe。2. -種如權(quán)利要求1所述的蒲公英籽抗氧化二肽的制備方法，其特征在于:從蒲公英中 籽經(jīng)分離純化后得到;具體步驟包括如下： 1) 酶解物的制備：蒲公英籽蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解，酶解條件為酶解時間4.90h、pH 8.5、酶底比7.80%、底物濃度為2%; 2) 分離純化:取蒲公英籽酶解物利用Sephadex G-25凝膠色譜進行分離，以去離子水為 洗脫液，流速〇. 3 mL/min，測量洗脫組分214 nm波長處的吸光值，并測定各吸收峰對應的洗 脫組分的DPPH自由基清除活力，收集活性較高的峰，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一 步分離;RP-HPLC的洗脫梯度為0~60 min，體積分數(shù)為5%~55% V/V乙腈;流速為2.0 mL/min， 檢測波長214 nm，收集體積分數(shù)為30% V/V乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗氧化二 肽。3. -種如權(quán)利要求1所述的蒲公英籽抗氧化二肽在抗氧化食品添加劑中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于蒲公英籽的抗氧化肽的氨基酸序列、制備方法及其應用。該抗氧化肽序列為Val-Phe（VF），體外實驗表明，該多肽可以有效清除DPPH、ABTS、羥基自由基和超氧陰離子等自由基。本發(fā)明所涉及的抗氧化肽具有結(jié)構(gòu)簡單、抗氧化活力強等特點，可作為現(xiàn)有人工合成抗氧化劑的優(yōu)良替代，對新型抗氧化食品添加劑開發(fā)與應用方面具有重要價值。
【IPC分類】A23L33/18, C12P21/06, C07K1/16, C07K5/062, C07K1/20
【公開號】CN105566446
【申請?zhí)枴緾N201610081160
【發(fā)明人】洪晶, 張楊, 胡磊, 孟春
【申請人】福州大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月5日