鼓氮氣4h。 必要時可進行兩次。
[0091] (6)乙酰化：50% (v/v)嗎啡啉NMP溶液脫保護，按上述方法洗樹脂。Ac20、DIEA 和NMP(V:V:V = 1:3:16)的混合液lml加入樹脂，鼓氮氣lh。必要時可進行兩次。
[0092] (7)抽干反應(yīng)液，用上述常規(guī)方法洗10遍，用甲醇（MeOH，lml)洗滌兩遍后抽 干，-20°C保存 。
[0093] (8)將多肽從樹脂上切下：取50mg樹脂于2ml EP管中，加入0· 3ml的TFA、TIPS 和氏0(^^￥ = 9. 5:0. 25:0. 25)震蕩反應(yīng)lh，樹脂過濾除去，用氮氣把剪切液吹干，然后加 入冷的0. 5ml的乙醚和正己烷（v:v = 4:1)的混合液；離心去上清，沉淀于空氣中揮干殘余 溶劑。
[0094] (9)多肽純化：將上述沉淀溶于10 %乙腈（v/v)的水溶液后用高效液相色譜進行 純化，250*10mm C18反相色譜，A液：0· 1% TFA(v/v)的水溶液，B液：0· 1% TFA(v/v)的乙 腈溶液；溶劑梯度：〇至30min 2至30% B液的梯度洗脫。
[0095] (10)圓二色譜表征：將產(chǎn)物 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2 溶于超純水以及10% TFE水溶液中測定⑶圖譜：取0. l-o. 5mg樣品分別溶于超純水和10% TFE水溶液中測CD波長范圍190nm-250n內(nèi)的色譜圖（圖1)，然后根據(jù)以下公式計算螺旋 含量；
[0096] alpha螺旋計算公式：
[0097] fH = ([ Θ ]〇bs215-[ θ ]C)/([ θ 1 00215-[ θ ]C)
[0098] [ Θ ]〇bs215 = Θ "l〇*C*Np* ι )
[0099] [ θ ] "215 = (-44000+250T) (1- κ /Np)
[0100] [ θ ]c = 2220-53Τ = 1054
[0101] Τ = 25°C, Κ = 4· 0, Νρ = 6 (對于五肽），I = 0· 1 (cm), C 為樣品摩爾濃度 Μ, fH 為平均螺旋含量，[θ 為218nm下實際摩爾橢圓率，θ "2^為218nm下極大摩爾橢圓 率，為無規(guī)卷曲摩爾橢圓率，Θ為橢圓率。
[0102] 其結(jié)果是，圓二色譜結(jié)果含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接天冬氨酸修飾的多肽在10% TFE下并未顯著提高，說明這一側(cè)鏈穩(wěn)定方法已經(jīng)將該五肽α螺旋提高到了最佳值。測定 條件為25°C。（圖1和表1)
[0103] 表1多肽III在25 °C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0104]
[0105] 多肽α螺旋二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時218nm(長 肽負峰位于222nm，短肽負峰會發(fā)生位移）、208nm為負峰且θ 218/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋 含量越高，而上述結(jié)果說明末端側(cè)鏈-尾鏈連接天冬氨酸修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的α螺旋 二級結(jié)構(gòu)。
[0106] 圖2為在不同溫度下含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接天冬氨酸修飾的多肽Θ 218變化情 況，說明在一定溫度范圍內(nèi)，含有經(jīng)過修飾的多肽均保持螺旋的構(gòu)象。測定條件為Η20。
[0107] 圖 3、圖 4 為該多膚純化后 HPLC(Waters 600, Agilent Zorbax SB_Aq:4· 6χ 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-10%，30min-30%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 結(jié)果，可找到對應(yīng)分子量 m/z = 527. 2620 [M+H]，549. 2397 [M+Na]。
[0108] 實施例2 :
[0109] 末端甲基化L型酒石酸修飾多肽（cyclo-1,4)-[L_tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]_NH 2的合成，即結(jié)構(gòu)式（IV )的合成：
[0110]
[0111] 實施例1中手性二酸換為甲基化的L型酒石酸。實驗步驟與實施例1相同，步驟 (5)直接可以得到產(chǎn)物，無需進行步驟(6)。經(jīng)過高效液相色譜純化可得到終產(chǎn)物，產(chǎn)物在 H20(25°C )中螺旋性提高。（圖5,表2)
[0112] 表2多肽IV在25°C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0113]
[0114] 多肽α螺旋二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時218nm(長 肽負峰位于222nm，短肽負峰會發(fā)生位移）、208nm為負峰且θ 218/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋 含量越高，而上述結(jié)果說明末端側(cè)鏈-尾鏈連接酒石酸修飾可以穩(wěn)定多肽的α螺旋二級結(jié) 構(gòu)。
[0115] 圖 6、圖 7 為該多膚純化后 HPLC(Waters 600, Agilent Zorbax SB_Aq:4· 6χ 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-10%，30min-30%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 結(jié)果，可找到對應(yīng)分子量 m/z = 530. 2611[M+H], 552. 2384[M+Na]。
[0116] 實施例3:
[0117] 末端 D 型天冬氨酸修飾多膚 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspValValDapAlaAla]-NH2 的合成，即結(jié)構(gòu)式（V)的合成：
[0118]
[0119] 實施例1中氨基酸序列換為兩個Val。實驗步驟與實施例1相同。經(jīng)過高效液相 色譜純化可得到終產(chǎn)物，經(jīng)穩(wěn)定的多肽在H 20(25°C)中呈現(xiàn)特征的α螺旋（圖9,表3)。
[0120] 表3多肽V在25°C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0121]
[0122] 多肽α螺旋二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時218nm(長 肽負峰位于222nm，短肽負峰會發(fā)生位移）、208nm為負峰且θ 218/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋 含量越高，而上述結(jié)果說明末端側(cè)鏈-尾鏈連接天冬氨酸修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的α螺旋 二級結(jié)構(gòu)，并且該方法具有較好的序列耐受性。
[0123] 圖 8、圖 10、圖 11 為該多肽粗產(chǎn)物，純化后 HPLC(Waters 600, Agilent Zorbax SB-Aq:4. 6x 250mm,乙腈 / 水：0min-2 %，5min-10 %，30min-30 % )及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)結(jié)果，可找到對應(yīng)分子量 m/z = 583. 3230[M+H], 605. 3018[M+Na]。
[0124] 實施例4:
[0125] 末端 D 型天冬氨酸修飾多膚 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspGlnValDapAlaAla]-NH2 的合成，即結(jié)構(gòu)式（VI)的合成：
[0126]
[0127] 實施例1中序列換為GlnVal。實驗步驟與實施例1相同。經(jīng)過高效液相色譜純化 可得到終產(chǎn)物，經(jīng)穩(wěn)定的多肽在H 20(25°C )中呈現(xiàn)特征的α螺旋（圖12,表4)。
[0128] 表4多肽VI在25 °C，Η20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0129]
[0130] 多肽α螺旋二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時218nm(長 肽負峰位于222nm，短肽負峰會發(fā)生位移）、208nm為負峰且θ 218/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋 含量越高，而上述結(jié)果說明末端側(cè)鏈-尾鏈連接天冬氨酸修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的α螺旋 二級結(jié)構(gòu)，并且該方法具有較好的序列耐受性。
[0131] 圖 13、圖 14 為該多肽純化后 HPLC(Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-10%，30min-30%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 結(jié)果，可找到對應(yīng)分子量 m/z = 612. 3190[M+H]，634. 2919[M+Na]。
[0132] 實施例5:
[0133] 末端 D 型天冬氨酸修飾長膚 HIF-1 α B D-TCD Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspGluLeu DapArgAlaValAspGln]-NH2的合成，即結(jié)構(gòu)式（W )的合成：
[0134]
[0135] 實施例1中序列換為HIF-1 α。實驗步驟與實施例1相同。經(jīng)過高效液相色譜純 化可得到終產(chǎn)物，經(jīng)穩(wěn)定的多肽在H20(25°C )中呈現(xiàn)特征的α螺旋（圖15,表5)。
[0136] 表5多肽W在25°C，H20中圓二色譜數(shù)據(jù)
[0137]
[0138] 多肽α螺旋二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜表征，其特征為190nm處為正峰，同時222nm、 208nm為負峰且θ 222/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋含量越高，而上述結(jié)果說明末端側(cè)鏈-尾鏈 連接天冬氨酸修飾可以顯著穩(wěn)定多肽的α螺旋二級結(jié)構(gòu)，并且該方法具