入發(fā)酵培養(yǎng)液中，每瓶接種3mL，靜置培養(yǎng)30天，溫度為28°C，得到含 有本發(fā)明具有抗HIV潛伏活性的化合物的發(fā)酵液。
[0083]三、化合物的分離
[0084]將含有本發(fā)明具有抗HI V潛伏活性的化合物的發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取2次， 所得萃取液濃縮。將所得乙酸乙酯部位進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為5:1的石油醚-乙酸乙 酯體系等度洗脫，薄層檢識(shí)(硫酸-香草醛顯色呈墨藍(lán)色)含有BFA系列化合物的餾分，合并。 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2 X250mm)色譜柱，檢 測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為65~50:35~50甲醇-水體系等度洗脫，收集色譜 峰，回收溶劑，即可得本發(fā)明的具有抗HIV潛伏活性的化合物。
[0085] 實(shí)施例 1F29-61A
[0086] 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2X250mm)色 譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為55:45甲醇-水體系以lOmL/min等度洗脫， 收集36-39min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物F29-61A，如圖1-4和1-5所示，依據(jù)核磁共振 數(shù)據(jù)，其結(jié)構(gòu)如下所示，為式I結(jié)構(gòu)，RA〇H; RAH; R3為Η; R4為OH; RdH; R6為CH3，分子式為 C16H24〇4，鑒定化合物為布雷菲德菌素 A。
[0087]
[0088] 按每孔2X 10E4個(gè)細(xì)胞將C11細(xì)胞種植于96孔板，每孔加入100yL含10%FBS (Gibco)的1640培養(yǎng)基(Gibco)。細(xì)胞經(jīng)F29-61A處理24/48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠 色熒光表達(dá)情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析熒光細(xì)胞所占比例。
[0089]圖1-1為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F29-61A對(duì)HIV潛伏的誘導(dǎo)激活效率圖；C11細(xì)胞未處理或 經(jīng)20ng/mL F29-61A處理24h后，流式細(xì)胞術(shù)分析熒光細(xì)胞所占比例。圖1-2為F29-61A在不 同的作用時(shí)間對(duì)Cl 1細(xì)胞潛伏HIV激活效率比較圖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F29-61A在不同的作用 時(shí)間對(duì)C11細(xì)胞系中潛伏HIV的激活效果，并繪制濃度依賴(lài)曲線。所有數(shù)據(jù)結(jié)果皆為通過(guò)3次 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)的平均值。圖1-3為F29-61A和對(duì)照藥Prostratin對(duì)C11細(xì)胞中潛伏HIV的 激活效率比較圖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度F29-61A和對(duì)照藥Prostratin對(duì)Cl 1細(xì)胞系中潛 伏HIV的激活效果，并繪制濃度依賴(lài)曲線。所有數(shù)據(jù)結(jié)果皆為通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)的 平均值。
[0090] 結(jié)果顯示，經(jīng)10ng/mL的F29-61A處理，細(xì)胞模型中表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞比例明顯 增加;其中，C11細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)20ng/mL(0.07yM)的F29-61A處理后綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例達(dá) 高達(dá)83%。未加誘導(dǎo)劑處理的HIV潛伏感染細(xì)胞，其熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例僅有約為1-3%的 背景激活。本發(fā)明結(jié)果提示，F(xiàn)29-61A對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞中的潛伏病毒具有高效的激活作 用。
[0091] 實(shí)施例 2F29-63F
[0092] 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2X250mm)色 譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為65:35甲醇-水體系以12mL/min等度洗脫， 收集36-40min的色譜峰，回收溶劑，即可得本發(fā)明的具有抗HIV潛伏活性的化合物F29-63F。 如圖2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7所示，依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)，鑒定化合物為7,7_ dimethoxybrefeldin C〇
[0093]
[0094] 實(shí)施例 3F29-84F
[0095] 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2X250mm)色 譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為50:50甲醇-水體系以lOmL/min等度洗脫， 收集26-30min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物F29-84F。如圖3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、 3- 7所示，依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)，鑒定化合物為6a-hydroxybrefeldin C。
[0096]
[0097] 實(shí)施例 4F29-85C
[0098] 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2X250mm)色 譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為65:35甲醇-水體系以lOmL/min等度洗脫， 收集28-32min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物F29-85C。如圖4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、 4- 7所示，依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)，鑒定化合物為4-epi-15-epi-brefeldin A。
[0099]
[0100] 實(shí)施例 5F29-87B
[0101] -、化合物的制備
[0102] 所得餾分用反相高效液相色譜分離（Sepax Amethyst C-18(5ym，21.2X250mm)色 譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為35:65乙腈-水體系以lOmL/min等度洗脫， 收集22-24min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物F29-87B。如圖5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、 5-7所示，依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)，鑒定化合物為4-6口;[-8€[-]17(11'(?7-15-6口;[-1^6€61(1;[11(：。
[0103]
[0104] 實(shí)施例2~5制備的化合物采用實(shí)施例1中的細(xì)胞模型檢測(cè)，結(jié)果表明，實(shí)施例2~5 制備的化合物對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞中的潛伏病毒具有高效的激活作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種布雷菲德菌素 A及其衍生物，其特征在于，為式I結(jié)構(gòu)：其中，町為Η、0H、邸3、0邸3、（0邸3) 2或者OCOC也； 化為Η、0Η、C也、0C也、（0C也)2或者OCOC也； R3為Η、0Η、C也、0C也、（0C也)2或者OCOC也； R4為Η、0Η、C也、0C也、（0C也）2或者OCOC也； Rs為Η、0Η、C也、0C也、（0C也)2或者OCOC也； R6為邸3。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布雷菲德菌素 A及其衍生物在制備抗HIV潛伏藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布雷菲德菌素 A及其衍生物與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合在制備 治療AIDS藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物為核巧類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄 酶抑制劑、非核巧類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、輔助受體括抗劑、逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶 抑制劑、病毒吸附抑制劑、特異性病毒轉(zhuǎn)錄抑制劑、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑中的一 種或兩種W上。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的核巧類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑為齊多夫 定、拉米夫定、司它夫定、阿己卡韋、地丹諾新、扎西他濱、恩曲他濱、（R)-9-(2-憐酷甲氧基 丙基)腺嚷嶺、替諾福韋、阿德福韋、氨多索韋、艾夫他濱、阿洛夫定、疊氮麟、福齊夫定替醋 中的一種或兩種W上。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的非核巧類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑為奈韋拉 平、依法韋倫、地拉韋晚、洛韋胺、依曲韋林、利匹韋林中的一種或兩種W上。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的蛋白酶抑制劑為利托那韋、洛匹那 韋、奈非那韋、沙奎那韋、巧地那韋、阿扎那韋、安普那韋、地瑞那韋、福沙那韋、替拉那韋中 的一種或兩種W上。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的整合酶抑制劑為雷特格韋、埃替拉 韋、度魯特韋中的一種或兩種W上。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的融合抑制劑為恩夫韋膚、替夫韋膚 中的一種或兩種W上。10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的治療AIDS藥物的劑型為片劑、丸 劑、膠囊劑、顆粒劑、小丸劑、溶液劑、分散劑、懸浮劑、乳劑、油劑中的一種或兩種W上。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種布雷菲德菌素A(BFA)及其衍生物和應(yīng)用，具有極強(qiáng)的抗HIV潛伏活性，該系列化合物利用靜置培養(yǎng)發(fā)酵方法以及化學(xué)修飾得到。本發(fā)明的布雷菲德菌素A及其衍生物為式I結(jié)構(gòu)，其中，R1至R5為H、OH、CH3、OCH3、(OCH3)2或者OCOCH3；R6為CH3?？勺鳛榭笻IV潛伏藥物，與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用在制備治療AIDS藥物中，與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)用時(shí)，BFA及其衍生物能使感染細(xì)胞內(nèi)潛伏的HIV表達(dá)，具有干預(yù)HIV潛伏的作用，與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，可清除被激活的潛伏感染的細(xì)胞，以此加速潛伏病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的清除，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】A61K45/06, A61K31/365, A61P31/18, C07D313/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105566277
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610053546
【發(fā)明人】馬忠俊, 胡志飛, 朱煥章
【申請(qǐng)人】杭州科興生物化工有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月25日