?底物 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為標(biāo)準(zhǔn)。
[0040] (3)配制抑6.4的化抽P〇4-Na出Ρ〇4緩沖液，將 5. Omg ARW !944化二甲基亞諷(DMS0) 溶解得lO.Ommol/L AR，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆?，使用時(shí)W超純水和DMS0稀釋至10-500μ mo 1/L，并使DMS0在AR溶液中體積分?jǐn)?shù)為5 % ;
[OOW (4) W步驟（3)中pH6.4的Na2HP04-Na出P04緩沖液為緩沖體系，W終濃度5.62- 702U/L漆酶，制作出終濃度1.0-50ymol/L AR時(shí)漆酶催化氧化AR的工作曲線，反應(yīng)時(shí)間為 10min，W3倍性噪比測(cè)出每個(gè)AR濃度下的最低檢測(cè)限，并W最低檢測(cè)限初始達(dá)到最低時(shí)的 AR濃度下的工作曲線作為最終工作曲線(詳見(jiàn)圖7)。
[0042] (5)配制1.0X10-6-1. Omol/L 的 CuS〇4，ZnS〇4，MnS〇4，F(xiàn)eS〇4，F(xiàn)e2(S04)3，Al2(S〇4)3， 化(：1，腺1，〔曰(：12，1旨(：12，^(：1，化(：12，〔(1(：12，(：〇(：12，心賴氨酸，甘氨酸，0-葡萄糖，苯酪，腐植 酸鋼溶液，W步驟(3)中抑6.4的化抽P化-Na此P〇4緩沖液為緩沖體系，W終濃度8. Ομπιο 1/L的 AR，0.5%DMS0，350U/L的漆酶，1.0 X 1〇-7-1.0 X l〇-Vol/L本步驟配制的干擾物質(zhì)溶液為反 應(yīng)體系，測(cè)定干擾物質(zhì)對(duì)漆酶-AR體系的干擾作用，結(jié)果表明本步驟測(cè)定得干擾物質(zhì)對(duì)漆 酶-AR體系無(wú)明顯干擾作用。
[0043] 實(shí)施例3應(yīng)用實(shí)施例
[0044] 本實(shí)施例是基于本發(fā)明的±壤漆酶活性的測(cè)定方法的具體應(yīng)用。首先是漆酶-AR 巧光反應(yīng)對(duì)±壤中常見(jiàn)酶類的選擇性測(cè)定，證明巧光信號(hào)的產(chǎn)生是由于±壤中存在漆酶活 性引起，其次是±壤對(duì)試面靈的巧光巧滅作用測(cè)定，±壤溶液濃度對(duì)漆酶活性測(cè)定影響，并 W實(shí)施例1中的漆酶催化氧化AR工作曲線測(cè)定±壤樣品中漆酶活性，并測(cè)定±壤pH值，W確 定其與±壤漆酶活性的相關(guān)性，最后測(cè)定±壤樣品加標(biāo)回收率。
[0045] 具體步驟如下：
[0046] (1)±壤采集與處理過(guò)程如下，撥開(kāi)±壤表層落葉，取表層5(3111的±壤，對(duì)不同采集 地點(diǎn)所采±樣分別編號(hào)后，W孔徑小于2mm的篩子過(guò)篩后于4°C保存?zhèn)溆?，待使用時(shí)，將±樣 置于55°C烘箱內(nèi)干燥12小時(shí)，所有±樣酶活測(cè)定在采集后14天內(nèi)完成。稱取干燥后的±壤 25±0.0 lg，用500血實(shí)施例1中抑6.4的Na2HP〇4-Na出P〇4緩沖溶液充分溶解，得5〇111旨/1^±壤 溶液，待使用時(shí)稀釋至0-50mg/mL。
[0047] (2)分別W終濃度8.0皿ol/L的AR，0.5 %的DMS0，600U/L的漆酶，堿性憐酸酶，脈 酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)化酶，葡萄糖氧化酶，過(guò)氧化氨酶，辣根過(guò)氧化物酶，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，儘 過(guò)氧化物酶W及酪氨酸酶，測(cè)定AR巧光反應(yīng)的選擇性，其中，除漆酶能使其產(chǎn)生較高巧光信 號(hào)外，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶能使其產(chǎn)生較低的巧光信號(hào)，其他酶幾乎不會(huì)使AR產(chǎn)生巧光信號(hào)， 表明±壤溶液使AR產(chǎn)生巧光信號(hào)主要是由±壤中的漆酶引起的。
[0048] (3)將滅菌±壤和未滅菌±壤溶液加入試面靈溶液中，W測(cè)定±壤溶液對(duì)產(chǎn)物試 面靈巧光信號(hào)的巧滅作用，±壤溶液終濃度為0-40mg/mL，試面靈終濃度為8.0ymol/L，結(jié)果 在測(cè)試±壤濃度范圍內(nèi)，±壤對(duì)試面靈巧光無(wú)明顯巧滅作用。
[0049] (4) W終濃度8.0ymol/L AR，0-40mg/mL±壤溶液測(cè)定±壤溶液濃度對(duì)±壤漆酶活 性影響，±壤溶液與AR反應(yīng)后，分別測(cè)定反應(yīng)混合液和上清的巧光信號(hào)，結(jié)果二者并無(wú)明顯 差別，表明此方法可直接測(cè)定±壤混濁液巧光信號(hào)來(lái)測(cè)定漆酶活性，且在0-10mg/mL±壤濃 度范圍內(nèi)，巧光信號(hào)與±壤濃度有較好的線性關(guān)系，故W終濃度5. 〇111邑/1^的±壤溶液，8.0μ mol/L的AR為反應(yīng)體系，檢測(cè)由±壤漆酶催化AR形成試面靈產(chǎn)生的巧光信號(hào)值F，并代入工 作曲線方程F = 0.1434化0.0151，得出相應(yīng)的漆酶活性U。
[0050] (5)±壤樣品抑值測(cè)定，稱取每份干燥后的±壤樣品200±0.01g，加500mL去離子 水充分溶解，離屯、取上清液測(cè)定pH值，最后得出±壤漆酶活性與pH值相關(guān)性。
[0051] 表1±壤樣品中漆酶加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果
[0化2]
[0053] (6)加標(biāo)回收率測(cè)定，取步驟(1)中干燥處理的5份不同采集地點(diǎn)的±壤樣品，測(cè)定 其漆酶酶活，為試樣測(cè)定值，向每份±壤樣品中分別加入等量漆酶，加標(biāo)量為25.5U/L，再測(cè) 定加標(biāo)±樣漆酶酶活，為加標(biāo)試樣測(cè)定值，加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值一試樣測(cè)定值)/ 加標(biāo)量X100%。酶活測(cè)定方法詳見(jiàn)步驟(4)。
[0054] 表1結(jié)果顯示，本方法測(cè)定±壤漆酶活性加標(biāo)回收率在93-100%范圍內(nèi)，說(shuō)明本方 法測(cè)定漆酶活性準(zhǔn)確度較好。
[0055] 附錄:本發(fā)明中實(shí)施例所用的主要試劑及相關(guān)儀器：
[0化6] 酶和試劑:所用漆酶(該漆酶來(lái)源于變色栓菌，Coriolus versicolor,該漆酶購(gòu)自 S igma公司），10-乙酷基-3，7-二徑基吩嗦(AR)，試面靈，2，3-二甲基化晚-N-氧化物(DMP0)， 超氧化物岐化酶(SOD)，堿性憐酸酶，脈酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)化酶，葡萄糖氧化酶，過(guò)氧化氨酶， 辣根過(guò)氧化物酶，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶W及儘過(guò)氧化物酶，酪氨酸酶，腐植酸鋼鹽均購(gòu)自 SIGMA公司，2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-橫酸）二錠鹽(ABTS)，二甲基亞諷(DMS0)， 正下醇，異下醇，巧樣酸，憐酸氨二鋼，憐酸二氨鋼，硫酸銅，硫酸鋒，硫酸儘，硫酸亞鐵，硫酸 鐵，硫酸侶，氯化鋼，氯化鐘，氯化巧，氯化儀，氯化裡，氯化儀，氯化儒，氯化鉆，k賴氨酸，甘 氨酸，D-葡萄糖，均購(gòu)買自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)。
[0化7]儀器：紫外分光光度計(jì)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），F(xiàn)luoroskan Ascent化巧 光化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀(賽默飛世爾科技），1-14Κ離屯、機(jī)(購(gòu)自SIGMA公司），PB-10酸度計(jì)(賽多 利斯科學(xué)儀器有限公司）。
[0化引主要參考文獻(xiàn)
[0059] [iKhaer,G.M. ;My;rold,D.D. ;Bottomley,P.J.A soil quality index based on the equilibrium between soil organic matter and biochemical properties of undisturbed coniferous forest soils of the Pacific NorthwestOriginal. Soil Biol.Biochem.2009,41,822-830.
[0060] [2]Fujii，K.;Uemura，M.;Hayakawa，C.;Funakawa，S.;Kosaki，T.Environmental control of lignin peroxidase,manganese peroxidase,and laccase activities in forest floor layers in humid Asia.Soil Biol.Biochem.2013，57，109-115.
[0061] [3]McCaig，B.C.;Mea組er，R.B.;Dean，J.F.D.Gene structure and molecular analysis of the laccase-like multicopper oxidase(LMCO)gene family in Arabidopsis 化aliana.Planta.2005,221,619-636.
[0062] [4]Dittmer，N.T.;Suderman,民.J.;Jiang，H.;Zhu，Y.C.;Gorman，M.J.;Kramer, Κ.J.;Kanost,Μ.民.Characterization of cDNAs encoding putative laccase-like multicopper oxidases and developmental expression in the tobacco hornworm, Manduca sexta，and the malaria mosquito,Anopheles gambiae. Insect Biochem Mol Biol.2004,34,29-41.
[0063] [ 5 ]Gianfreda，L . ; Xu，F(xiàn) . ; Bol lag，J . M . Laccases : A Useful Group of Oxidoreductive Enzymes.Bioremed.J.1999，3，1-26.
[0064] [6]Alexandre,G.；Zhulin,I.B.Laccases are widespread in bacteria.Trends Biotechnol.2000,18,41-42.
[006日][7]Rivera_Hoyos，C·M.;Morales_Alvarez，E·D·;Poutou-Pinales，R·A·; Pedroza-民odriguez，A.M.;民odriguez-Vazquez，民.；Delgado-Boada，J.M. Fungal laccases·i^ngal Biol·Rev·2013，27，67-82·
[0066] [8]Sinsabaugh,民.L.Phenol oxidase，peroxid