專利名稱：一種膠原蛋白酶酶活的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白酶酶活測定方法，尤其涉及一種膠原蛋白酶酶活的測定方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白(Collagen)是由動物細胞合成的一種相對分子量在30萬以上的生物高分子，廣泛存在于動物骨骼、肌腱、軟骨、皮膚及其它結(jié)締組織中，約占哺乳動物總蛋白的1/3，骨骼與肌鍵中總蛋白的90%以上，皮膚中總蛋白的50%以上，膠原蛋白具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)，很難被一般的蛋白酶水解，只能被膠原蛋白酶特異性水解。膠原蛋白酶(colIagenase),是一種以水解不溶性膠原蛋白蛋白為特征的蛋白水解酶,在多個蛋白酶家族，如金屬蛋白酶家族和絲氨酸蛋白酶家族中均有存在，目前，膠原蛋白酶已廣泛應(yīng)用于醫(yī) 藥、食品等領(lǐng)域在工業(yè)開發(fā)中應(yīng)用于膠原分級降解以獲得膠原多肽；在醫(yī)學(xué)研究中用于治療椎間盤突出癥等；實驗室研究中作為工具酶應(yīng)用于細胞和器官的分離；基礎(chǔ)研究中應(yīng)用于膠原結(jié)構(gòu)的研究。李陳(《膠原蛋白酶活性的測定方法》，中國皮革，2008,37(11) : 24-25 )等人綜述了膠原蛋白酶活性測定方法以酪蛋白作為底物，反應(yīng)體系為0. ImL酶液，ImLO. 6%酪蛋白溶液，50mmol/L ρΗ7· 5 Tris-HCl, 4mmol/L CaCl2, 30°C水浴 lOmin，然后用 10% 的三氯乙酸終止反應(yīng),水解釋放出來的酸性肽在273nm下測定吸光值，酶活力定義為每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于等量酪氨酸微摩爾數(shù)為一個酶活力單位?，F(xiàn)有技術(shù)存在的問題是酶活定義的標(biāo)準不統(tǒng)一，存在底物差異性，酶活數(shù)據(jù)不一致，測量精度不高，從而影響了膠原蛋白酶及其相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用和推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的膠原蛋白酶酶活檢測標(biāo)準不統(tǒng)一、存在底物差異性、酶活數(shù)據(jù)不一致的不足，提供了一種標(biāo)準統(tǒng)一、克服底物差異性、酶活數(shù)據(jù)一致、測量精度高的膠原蛋白酶酶活的測定方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，包括如下步驟
①試劑準備準備濃度為O.lmol/LpH7. 5的Tris · Cl緩沖液、體積分數(shù)10%的三氯乙酸溶液、O. 6^0. 8mol/L的鄰苯二甲醛溶液、O. 3mmol/L的羥脯氨酸標(biāo)準液、2mol/L的乙酸緩沖液、茚三酮顯色液、體積分數(shù)60%的醇溶液；
②羥脯氨酸梯度樣品制備分別移取羥脯氨酸標(biāo)準液適量于比色管中稀釋定容至同一體積，制成濃度為O. 03、. 3μ mol/mL的若干羥脯氨酸梯度樣品，取與羥脯氨酸梯度樣品相同體積的蒸餾水于比色管中作為參照樣品；
③羥脯氨酸梯度樣品測定向參照樣品和各羥脯氨酸梯度樣品中分別加入與羥脯氨酸梯度樣品體積相等的乙酸緩沖液和茚三酮顯色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加熱15 20min，冷卻，放置lOmin，然后加入羥脯氨酸梯度樣品體積3倍的醇溶液稀釋，以參照樣品為參比溶液，在520nm處測各羥脯氨酸梯度樣品的吸光值，根據(jù)羥脯氨酸梯度樣品的濃度C和吸光值A(chǔ)作出C-A標(biāo)準曲線，并擬合出標(biāo)準曲線公式；
④待測酶解液制備稱取O.8^1. 2mg膠原底物，加入O. 4^0. 6mlTris · Cl緩沖液，于35 40°C預(yù)熱8 12min，加入O. Iml待測酶液，所述待測酶液體積記為V2，于35 40°C酶解反應(yīng)Tmin，所述T的值為25 35，然后加入O. 5 O. 7ml三氯乙酸溶液搖勻，接著加入O. 5 O. 7ml的鄰苯二甲醛溶液搖勻，最后加入O. Γ0. 6g硅膠，攪勻后靜置5lmin，離心得上清液，該上清液體積記為V1，所述上清液稀釋N倍后作為待測酶解液；
⑤空白液制備稱取O.8 1. 2mg膠原底物，加入O. 4^0. 6ml Tris · Cl緩沖液，于35 40°C預(yù)熱8 12min，加入O. 5 O. 7ml三氯乙酸溶液搖勻，然后加入O. Iml待測酶液，于35 40°C酶解反應(yīng)25 35min，再加入O. 5 O. 7ml的鄰苯二甲醛溶液搖勻，最后加入O. 4 O. 6g硅膠，攪勻后靜置5lmin，離心得上清液，所述上清液稀釋N倍后作為空白液，其中N的值與步驟④中的N值相同；
⑥酶活力的測定取待測酶解液和空白液各一定體積于比色管中，所述體積記為V3,分別加入V3體積的乙酸緩沖液和茚三酮顯色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加熱15 20min，冷卻，放置lOmin，然后加入3倍V3體積的醇溶液稀釋，以空白液為參比溶液，測待測酶解液在520nm處的吸光值；
⑦測出待測酶解液吸光值A(chǔ)后，代入步驟③得到的標(biāo)準曲線公式中得到對應(yīng)的待測酶解液中的羥脯氨酸濃度C ；
⑧膠原蛋白酶酶活的計算計算公式如下
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權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述的測定方法包括如下步驟 ①試劑準備準備濃度為0.lmol/LpH7. 5的Tris Cl緩沖液、體積分數(shù)10%的三氯乙酸溶液、0. 6^0. 8mol/L的鄰苯二甲醛溶液、0. 3mmol/L的羥脯氨酸標(biāo)準液、2mol/L的乙酸緩沖液、茚三酮顯色液、體積分數(shù)60%的醇溶液； ②羥脯氨酸梯度樣品制備分別移取羥脯氨酸標(biāo)準液適量于比色管中稀釋定容至同一體積，制成濃度為0. 03^0. 3umol/mL的若干羥脯氨酸梯度樣品，取與羥脯氨酸梯度樣品相同體積的蒸餾水于比色管中作為參照樣品； ③羥脯氨酸梯度樣品測定向參照樣品和各羥脯氨酸梯度樣品中分別加入與羥脯氨酸梯度樣品體積相等的乙酸緩沖液和茚三酮顯色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加熱15 20min，冷卻，放置lOmin，然后加入羥脯氨酸梯度樣品體積3倍的醇溶液稀釋，以參照樣品為參比溶液，在520nm處測各羥脯氨酸梯度樣品的吸光值，根據(jù)羥脯氨酸梯度樣品的濃度C和吸光值A(chǔ)作出C-A標(biāo)準曲線，并擬合出標(biāo)準曲線公式； ④待測酶解液制備稱取0.8^1. 2mg膠原底物，加入0. 4^0. 6mlTris Cl緩沖液，于35 40°C預(yù)熱8 12min，加入0. Iml待測酶液，所述待測酶液體積記為V2，于35 40°C酶解反應(yīng)Tmin，所述T的值為25 35，然后加入0. 5 0. 7ml三氯乙酸溶液搖勻，接著加入0. 5 0. 7ml的鄰苯二甲醛溶液搖勻，最后加入0. 4^0. 6g硅膠，攪勻后靜置5lmin，離心得上清液，該上清液體積記為V1，將所述上清液稀釋至濃度0. 03、. 3 u mol/mL作為待測酶解液，稀釋倍數(shù)記為N ； ⑤空白液制備稱取0.8^1. 2mg膠原底物，加入0. 4^0. 6ml Tris Cl緩沖液，于35 40°C預(yù)熱8 12min，加入0. 5 0. 7ml三氯乙酸溶液搖勻，然后加入0. Iml待測酶液，于35 40°C酶解反應(yīng)25 35min，再加入0. 5 0. 7ml的鄰苯二甲醛溶液搖勻，最后加入0. 4 0. 6g硅膠，攪勻后靜置5lmin，離心得上清液，所述上清液稀釋N倍后作為空白液； ⑥酶活力的測定取待測酶解液和空白液適量于比色管中，體積記為V3，分別加入V3體積的乙酸緩沖液和茚三酮顯色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加熱15 20min，冷卻，放置lOmin，然后加入3倍V3體積的醇溶液稀釋，以空白液為參比溶液，測待測酶解液在520nm處的吸光值； ⑦測出待測酶解液吸光值A(chǔ)后，代入步驟③得到的標(biāo)準曲線公式中得到對應(yīng)的待測酶解液中的羥脯氨酸濃度C ； ⑧膠原蛋白酶酶活的計算計算公式如下酶活(jjj= Cx^xMWxN 、式T 其中，C為待測酶解液中羥脯氨酸的濃度為上清液體積,為羥脯氨酸分子量'N%上清液稀釋倍數(shù)為待測酶液體積為酶解反應(yīng)時間。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，步驟②中所述適量是指0. n. 0ml，所述同一體積是指1ml，所述濃度為0. 03、. 3 u mol/mL的羥脯氨酸梯度樣品的數(shù)量為6個、7個或8個。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述6個羥脯氨酸梯度樣品的濃度依次為0. 03,0. 06,0. 12,0. 18,0. 24,0. 30 u mol/mL ;所述7個羥脯氨酸梯度樣品的濃度依次為0. 03,0. 06,0. 12,0. 15,0. 18,0. 24,0. 30 u mol/mL ;所述8個羥脯氨酸梯度樣品的濃度依次為 0. 03,0. 06,0. 12,0. 15,0. 18,0. 21,0. 24,0. 30 y mol/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述的醇溶液為乙醇溶液或異丙醇溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述的膠原底物是指不溶性膠原蛋白或明膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3或4或5所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述的待測酶液是由成品膠原蛋白酶配制成的0. 2mg/L的酶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3或4或5所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，所述的硅膠為細孔硅膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3或4或5所述的一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，其特征是，步驟④中上清液稀釋至濃度0. 12^0. 24 u mol/mL作為待測酶解液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原蛋白酶酶活的測定方法，旨在克服現(xiàn)有技術(shù)存在的酶活檢測標(biāo)準不同一、數(shù)據(jù)一致性差等問題，所述的測定方法包括如下步驟①試劑準備；②羥脯氨酸梯度樣品制備；③羥脯氨酸梯度樣品測定，根據(jù)測定的吸光值A(chǔ)和羥脯氨酸梯度樣品濃度C作出C-A標(biāo)準曲線，并擬合出標(biāo)準曲線公式；④待解酶解液制備，以不溶性膠原蛋白或明膠為膠原底物，加入待測酶液酶解反應(yīng)，離心得上清液，上清液稀釋制得待測酶解液；⑤空白液制備；⑥酶活力測定，將待測酶解液按步驟③的操作條件測出其吸光值A(chǔ)；⑦待測酶解液中羥脯氨酸濃度的計算；⑧膠原蛋白酶酶活力計算。本發(fā)明具有酶活檢測標(biāo)準統(tǒng)一、克服了底物差異性、測量精度高、酶活數(shù)據(jù)一致的特點。
文檔編號G01N21/31GK102809541SQ20121014703
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者周宇芳, 朱鵬, 楊會成, 廖妙飛, 肖金星, 鐘明杰, 付萬冬 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院