一種土壤漆酶活性的熒光測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于±壤化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種±壤漆酶活性的巧光測(cè)定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] ±壤酶是有機(jī)物質(zhì)降解和養(yǎng)分循環(huán)的主要生物機(jī)制，酶活性可指示微生物活性， 衰變率W及微生物或植物吸收物質(zhì)的可利用性。通過(guò)測(cè)定±壤酶活性，可W更好地了解微 生物群落功能，資源可利用性和生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程之間的關(guān)系，W及生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)自然和人為 干擾的功能機(jī)制E1'23。
[0003] 漆酶廣泛分布于植物W，昆蟲W，真菌及一些細(xì)菌中W，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道:漆酶能 夠W氧分子作為最終電子受體W，催化氧化各種有機(jī)污染物，例如多環(huán)芳香控、多氯聯(lián)苯、 合成染料、殺蟲劑、W及鐵-氯化物復(fù)合物W等。因此，漆酶在各種生理功能中具有重要意 義，如碳循環(huán)、形態(tài)建成、防御和寄生等。在±壤和落葉等復(fù)雜環(huán)境中，測(cè)定漆酶活性最 常用的方法是比色法，常用底物有下香醒連氮（3,5-二甲氧基-4-徑基苯甲醒連氮），ABTS (2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽)等W。最初，下香醒連氮被用作漆酶最常 用底物[8'9'12^，但下香醒連氮形成的的釀?lì)惍a(chǎn)物不溶于水，因此運(yùn)種方法的使用受到了限 制[133?；痳net等人改造了下香醒連氮的結(jié)構(gòu)，使漆酶催化其產(chǎn)生新的水溶性產(chǎn)物，該方法 已被用于落葉提取物中漆酶活性的測(cè)定，但其報(bào)道的所有下香醒連氮衍生物的釀?lì)惍a(chǎn)物吸 光度不穩(wěn)定，因此運(yùn)種方法也具有一定局限性。目前，一般采用ABTS法測(cè)定±壤及相關(guān) 樣品中漆酶活性，其原理是:ABTS在漆酶存在的條件下能夠產(chǎn)生有顏色的陽(yáng)離子自由基 ABTS' +。但是在±壤、落葉等復(fù)雜介質(zhì)中，許多分子能夠消除ABTS' +自由基發(fā)生稱色反應(yīng)，造 成測(cè)定的漆酶活性低于其實(shí)際值。
[0004] 需要指出的是，傳統(tǒng)方法需要將漆酶從±壤中提取出來(lái)進(jìn)行顯色反應(yīng)并實(shí)現(xiàn)漆酶 活性測(cè)定UW;但是，酶提取過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)；只能提取出很少部分漆酶;并且其提取效率隨 ±壤變化而不同W3。此外，采用不同的萃取試劑，相同的±壤萃取效率也會(huì)有所不同。因 此，現(xiàn)有的漆酶測(cè)定方法所獲得的測(cè)定結(jié)果不能反應(yīng)±壤中漆酶活性的真實(shí)結(jié)果，嚴(yán)重阻 礙了漆酶在±壤中功能和作用的相關(guān)研究。因此，發(fā)展直接測(cè)定±壤中漆酶活性的新方法 對(duì)于±壤科學(xué)及相關(guān)科學(xué)研究、促進(jìn)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有十分重要的意義。
[0005] 巧光檢測(cè)由于其具有靈敏度高、線性動(dòng)態(tài)范圍寬、反應(yīng)快、精確度高、選擇性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。Amplex RedQO-乙酷基-3,7-二徑基苯嗯 嗦，AR)是試面靈的一種衍生物，無(wú)色且無(wú)巧光性。研究表明：AR能夠通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶- 過(guò)氧化氨體系被氧化為具強(qiáng)巧光性的試面靈，該反應(yīng)體系由此被開發(fā)用于各種檢測(cè)試劑 盒W-W。但是，AR用于漆酶活性測(cè)定及其應(yīng)用的研究尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。通過(guò)研究，我們首 次發(fā)現(xiàn)漆酶能夠在溶解氧條件下催化氧化無(wú)巧光性的AR形成具強(qiáng)巧光性、有色的試面靈。 基于運(yùn)一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出一種新型巧光方法用于測(cè)定±壤中漆酶活性，其優(yōu)點(diǎn)包括:靈敏 度及選擇性高、線性范圍寬、無(wú)需復(fù)雜提取程序并可W直接用于±壤中漆酶活性測(cè)定、操作 簡(jiǎn)單快速、運(yùn)行價(jià)格低等。因此，本發(fā)明在環(huán)境污染修復(fù)、上壤及相關(guān)科學(xué)等研究領(lǐng)域有重 要實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)± 壤漆酶活性的巧光測(cè)定方法，該方法克服了傳統(tǒng)方法用于測(cè)定±壤漆酶活性偏低、操作復(fù) 雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。本發(fā)明還闡明漆酶催化AR巧光反應(yīng)機(jī)制，最后，本發(fā)明將所建立的巧光 測(cè)定方法成功應(yīng)用于±壤樣品漆酶活性的檢測(cè)，顯示了其潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 具體地，本發(fā)明提供了一種測(cè)定±壤漆酶活性的巧光新方法，該方法是WAmplex Red( 10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯嗦，簡(jiǎn)稱AR)為漆酶底物，直接測(cè)定±壤漆酶活性。
[000引本發(fā)明通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
[0009] -種±壤漆酶活性的巧光測(cè)定方法，包括下列步驟：
[0010] W 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽(簡(jiǎn)稱ABTS，下同）為漆酶底物， W分光光度法，制作漆酶催化氧化Amplex Red( 10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯嗦，簡(jiǎn)稱AR)的 工作曲線，對(duì)±壤漆酶活性進(jìn)行檢測(cè)，所述的方法步驟如下：
[001。 （ 1)配審ijpH4.4的化抽P04-巧樣酸緩沖溶液，5. Ommol/L的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯 并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽，即ABTS溶液，在避光條件下放置，另外配制10.0 mg/mL的漆酶溶液； [001 ^ (2似步驟（1)的化2冊(cè)04-巧樣酸緩沖液為緩沖體系，終濃度為0.5mmol/L ABTS， 5. Oyg/mL漆酶為反應(yīng)體系，測(cè)定4min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD420的變化，每間隔Imin測(cè)定一次，共讀數(shù) 5次;根據(jù)4min內(nèi)OD420的變化值，得出漆酶酶活，酶活定義W每min催化?μL?ο?底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn) 物的酶量為標(biāo)準(zhǔn)；
[001引 （3)配制抑6.4的化抽P04-Na此Ρ04緩沖液，將5. Omg的10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯 嗦(AR)W1944化二甲基亞諷(DMS0)溶解得lO.Ommol/L AR，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆茫褂?時(shí)用超純水和DMS0稀釋至10-500皿01/L，并使DMS0在AR溶液中體積分?jǐn)?shù)為5 % ;
[0014] (4) W步驟（3)中pH6.4的Na2冊(cè)〇4-Na出P〇4緩沖液為緩沖體系，W終濃度分別為 1.0-50.0 皿ol/L 的 AR，0.5 %DMS0，5.62-702U/L漆酶為反應(yīng)體系，分別制作出 1.0-50ymol/L 底物濃度下漆酶催化氧化AR的工作曲線，W3倍性噪比測(cè)出每個(gè)AR濃度下的最低檢測(cè)限，并 W最低檢測(cè)限初始達(dá)到最低時(shí)的AR濃度下的工作曲線作為最終工作曲線；
[001引 （5似步驟（3)中抑6.4的化抽P04-Na此P04緩沖液為緩沖體系，終濃度5.0mg/mL± 壤溶液，8.0ymol/L AR為反應(yīng)體系，檢測(cè)由±壤漆酶催化AR形成試面靈產(chǎn)生的巧光信號(hào)值 F，并代入工作曲線方程F = 0.1434化0.0151 (式中的F代表±壤漆酶催化AR形成試面靈產(chǎn)生 的巧光信號(hào)值;U代表漆酶的酶活，單位是U/L)，得出相應(yīng)的漆酶活性U。
[0016] 更詳細(xì)的的技術(shù)方案見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1:漆酶催化氧化AR前后巧光光譜變化圖。
[0018] 圖2:漆酶催化氧化AR所得產(chǎn)物液質(zhì)圖譜。
[0019]圖3:巧滅劑對(duì)漆酶-AR體系影響結(jié)果圖。
[0020]圖4:漆酶對(duì)AR溶液的電子順磁共振信號(hào)影響結(jié)果圖。
[0021] 圖5:漆酶催化氧化AR機(jī)理圖。
[0022] 圖6:不同AR濃度下的最低檢測(cè)限折線圖。
[0023] 圖7:最適AR濃度下漆酶工作曲線圖。
[0024] 圖8:干擾離子對(duì)漆酶活性測(cè)定影響柱狀圖。
[0025] 圖9:43對(duì)±壤酶選擇性柱狀圖。
[0026] 圖10:±壤對(duì)試面靈巧光巧滅作用柱狀圖。
[0027] 圖11 :±壤濃度對(duì)漆酶活性測(cè)定影響折線圖。
[0028] 圖12: ±壤濃度與巧光強(qiáng)度線性關(guān)系圖。
[0029] 圖13:上壤抑-漆酶活性相關(guān)性結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1漆酶催化氧化AR形成試面靈的反應(yīng)(基礎(chǔ)實(shí)施例）
[0031 ] 具體步驟如下：
[0032] (1)對(duì)漆酶催化氧化AR的產(chǎn)物進(jìn)行液質(zhì)分析，結(jié)果表明所得產(chǎn)物為試面靈。
[0033] (2)在有漆酶存在和無(wú)漆酶存在條件下，分別對(duì)AR溶液進(jìn)行電子順磁共振測(cè)定。實(shí) 驗(yàn)組W抑6.4Tris-HCl為緩沖體系，0.1 mmol/L AR，0.1 mg/mL超氧化物岐化酶，0.1mol/L正 下醇，0.16mol/L 2，3-二甲基化晚-N-氧化物(DMP0)，1. Omg/血漆酶為反應(yīng)體系，對(duì)照組不 加漆酶，檢測(cè)自由基信號(hào)，結(jié)果對(duì)照組檢測(cè)到自由基，實(shí)驗(yàn)組未檢測(cè)到自由基信號(hào)，表明反 應(yīng)過(guò)程中有中間產(chǎn)物自由基的形成，漆酶使自由基信號(hào)消失。
[0034] (3)向漆酶-AR反應(yīng)體系中加入超氧化物岐化酶(SOD)抑制氧生成化分別加入正 下醇和異下醇抑制H0'的產(chǎn)生;再分別對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行除氧和加氧處理，對(duì)照組不作處理。 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，只有除氧處理時(shí)，巧光信號(hào)明顯下降；加氧處理時(shí)，巧光信號(hào)明顯 升高，而加入S0D，正下醇，異下醇則對(duì)巧光信號(hào)無(wú)明顯影響，W上結(jié)果表明，氧W分子氧的 形式直接參與反應(yīng)。
[0035] 實(shí)施例2制備實(shí)施例
[0036] 本實(shí)施例采用分光光度法，WABTS為底物對(duì)漆酶酶活進(jìn)行測(cè)定，制作出漆酶催化 氧化AR的工作曲線，并測(cè)定各種干擾離子對(duì)漆酶-AR反應(yīng)體系的干擾作用。
[0037] 具體步驟如下：
[003引 （1)配制抑4.4的化抽P04-巧樣酸緩沖溶液，5. Ommol/L的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯 并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽即ABTS溶液，于避光條件下放置，另外配制10.0 mg/mL的漆酶溶液；
[0039] (2似步驟（1)中化抽P0廣巧樣酸緩沖液為緩沖體系，終濃度為0.5mmol/L ABTS溶 液，5 . Oyg/mL漆酶溶液為反應(yīng)體系，測(cè)定4min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD420的變化，每間隔Imin測(cè)定一 次，共讀數(shù)5次。根據(jù)4min內(nèi)OD420的變化率，得出漆酶酶活，酶活定義為每min催化?μL?ο