專利名稱：聯(lián)用積分法和初速度法測定酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于臨床檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)等領(lǐng)域測定酶活性的方法，其特征是用經(jīng)典初速度法測定低活性酶反應(yīng)體系的初速度，用積分法測定高活性反應(yīng)體系的酶反應(yīng)最大速度，通過換算成優(yōu)化底物濃度下的初速度，使積分法和初速度法的響應(yīng)曲線變成同一條直線，從而用較低的底物濃度獲得更高的線性響應(yīng)上限和更寬的線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。

背景技術(shù)：
測定酶活性是臨床檢驗(yàn)和環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)等領(lǐng)域的常規(guī)工作。目前測定酶活性常用初速度法，但需用盡可能高的底物濃度以獲得較高的線性響應(yīng)上限和較寬的線性響應(yīng)范圍。當(dāng)?shù)孜锶芙舛扔邢?，或高濃度底物有抑制或激活作用，或底物成本限制時，經(jīng)典初速度法的線性范圍較窄。用積分速度方程分析酶反應(yīng)過程可測定酶活性，此即積分法。經(jīng)典積分法為降低計(jì)算工作量將積分速度方程轉(zhuǎn)換成線性形式，但所用方程的自變量含隨機(jī)誤差，且易受反應(yīng)起點(diǎn)誤差等的影響，可靠性太低而無法應(yīng)用。隨著常規(guī)計(jì)算能力的顯著提高，用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程非線性擬合酶反應(yīng)動力學(xué)過程曲線成為新的酶反應(yīng)動力學(xué)過程分析方法，此即新積分法，其所用底物濃度更低而線性響應(yīng)上限更高。積分法要求被分析數(shù)據(jù)中底物消耗比例越高越好，其初始底物濃度越低則對底物消耗最低比例要求也越低，但其下限一般在40％左右。因此，當(dāng)待測樣品活性低時，就需很長的測定時間記錄酶反應(yīng)的動力學(xué)過程，使得其分析效率無法得到保證。另外，現(xiàn)有偶聯(lián)酶反應(yīng)體系都要求偶聯(lián)工具酶活性盡可能高，否則線性上限很低，而用積分法分析偶聯(lián)酶反應(yīng)動力學(xué)過程至今沒有成為常規(guī)方法。
經(jīng)典初速度法測定酶活性的最大優(yōu)勢是分析效率高，而積分法的最大優(yōu)勢是在更低的底物濃度下線性響應(yīng)上限卻更高。理論上預(yù)期，將積分法與初速度法聯(lián)用有望在較低底物濃度下既提高測定效率，又顯著提高線性響應(yīng)上限，從而有效拓寬線性響應(yīng)范圍。這種策略已嘗試過(見Biochem J，1975，149305-312；Biochem J，1982；203117-123；Biochem J，1985；22855-60)，但這些嘗試中，當(dāng)被分析的酶反應(yīng)曲線中底物消耗比例超過50％以后反而偏差越來越大，尤其對反應(yīng)起點(diǎn)誤差和初始底物濃度誤差也很敏感，不能常規(guī)應(yīng)用。
此前嘗試的聯(lián)用方法中所用積分速度方程的自變量都不是反應(yīng)時間，都含有隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，這可能是其可靠性低的原因。但如用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程分析酶反應(yīng)過程，有望使積分法測定酶活性對反應(yīng)起點(diǎn)誤差不明感，在底物消耗比例較高時可靠性更高，從而可同經(jīng)典初速度法聯(lián)用測定酶活性而拓寬線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是聯(lián)用積分法和經(jīng)典初速度法測定酶活性，從而用中等底物濃度獲得更高的線性響應(yīng)上限和更寬的線性響應(yīng)范圍，并保障分析效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用中等底物濃度，在酶活性足夠高時，對偶聯(lián)酶反應(yīng)用積分法測定初速度、對單一酶反應(yīng)用積分法測定最大反應(yīng)速度再換算成優(yōu)化初始底物濃度下的初速度；在酶活性較低時，直接用經(jīng)典初速度法測定酶活性。此聯(lián)用方法的關(guān)鍵是兩種方法測定酶活性對酶量線性響應(yīng)斜率相同，對兩種方法都能測定的酶樣品給出相同的酶活性，其特征在于 (一)、取一定量所需緩沖液加入試管內(nèi)，再加入一定量底物溶液；單一酶反應(yīng)體系的初始底物濃度在待測酶米氏常數(shù)0.10到10倍之間；對偶聯(lián)一個工具酶的偶聯(lián)酶反應(yīng)體系，待測酶的底物濃度設(shè)置與用經(jīng)典初速度法完全相同(即待測酶的底物濃度高于對應(yīng)米氏常數(shù)的10倍，偶聯(lián)工具酶的指示底物濃度為檢測儀器線性響應(yīng)范圍的上限或盡可能高)； (二)、將上述溶液混勻后在選定溫度(25～37℃)下恒溫5～10分鐘； (三)、在上述溶液中加入待測酶液，立即混勻，迅速將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到比色杯(或其它可連續(xù)監(jiān)測酶反應(yīng)過程的檢測器樣品室)； (四)、延遲15秒，以1～30秒間隔記錄對待測底物或產(chǎn)物線性響應(yīng)的檢測信號(如光吸收)，共記錄3分鐘以上(10分鐘以內(nèi))獲得底物或產(chǎn)物隨時間變化的反應(yīng)曲線(偶聯(lián)酶反應(yīng)體系用1秒間隔記錄)，監(jiān)測反應(yīng)的時間不超過10分鐘； (五)、數(shù)據(jù)過濾，去掉相鄰數(shù)據(jù)點(diǎn)中對應(yīng)的檢測信號變化小于儀器檢測噪聲2倍的數(shù)據(jù)(即去掉底物或產(chǎn)物濃度無顯著變化的數(shù)據(jù))； (六)、將單一酶單底物反應(yīng)微分速度方程積分成以反應(yīng)時間為自變量的形式，將偶聯(lián)一個工具酶的微分速度方程數(shù)值積分成以反應(yīng)時間為自變量的形式(數(shù)值積分步長0.1秒)，如存在產(chǎn)物抑制則在此積分速度方程中需包含產(chǎn)物抑制的效應(yīng)。
如監(jiān)測反應(yīng)過程中逐漸增加的瞬時吸收Ai，被測物質(zhì)摩爾消光系數(shù)為ε，反應(yīng)體系最大吸收為Am，本底為Ab，酶對底物的米氏常數(shù)為Km；當(dāng)用硫代丁酰膽堿為底物(加巰基顯色劑)測定血清丁酰膽堿酯酶(單一酶)反應(yīng)的產(chǎn)物吸收增加過程(來自硫代丁酰膽堿巰基水解生成的反應(yīng)產(chǎn)物吸收的增加過程)，可用如下的積分速度方程非線性擬合 -ln(Am-Ai)+Ai/(ε×Km)＝a+b×t[1] 當(dāng)用丙酮酸和NADH為底物測定乳酸脫氫酶反應(yīng)的底物消耗(NADH吸收下降)過程，可用如下積分速度方程非線性擬合反應(yīng)曲線 -ln(Ai-Ab)-Ai/(ε×Km)＝a+b×t[2] 當(dāng)用γ-谷氨?；鶎ο趸桨泛碗p甘肽為底物測定存在產(chǎn)物競爭性抑制的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)活性，設(shè)產(chǎn)物γ-谷氨酰雙甘肽的抑制常數(shù)同另一個產(chǎn)物對硝基苯胺的摩爾消光系數(shù)乘積為Aki，用包含產(chǎn)物抑制的如下積分速度方程非線性擬合反應(yīng)曲線 -Km×(Aki+Am-Ab)/Aki×ln(Am-Ai)+(1/ε-Km/Aki)×(Am-Ai)＝a+b×t [3] 對上述單一酶反應(yīng)體系，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程非線性擬合反應(yīng)曲線，所得對應(yīng)的速度(即方程[3]中系數(shù)b)為最大反應(yīng)速度。此方程不同于此前報(bào)道的GGT反應(yīng)動力學(xué)機(jī)制模型(Biochem J，1976，157609-617)，適用于分析底物濃度低于酶Km的反應(yīng)曲線。當(dāng)所用底物濃度高于酶Km時，用文獻(xiàn)報(bào)道的模型與用此模型所得結(jié)果相近。
當(dāng)用丙氨酸加α-酮戊二酸為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)底物，以NADH為指示底物，偶聯(lián)乳酸脫氫酶(LDH)，用數(shù)值積分速度方程迭代擬合反應(yīng)曲線確定ALT活性(VALT)，所用方程組如下 其中，NADH1表示前一記錄點(diǎn)對應(yīng)的NADH濃度，NADH2表示據(jù)當(dāng)前的丙酮酸(PYR)濃度、NADH濃度和LDH活性遞歸推算的下一記錄點(diǎn)的NADH濃度，PYR1表示前一記錄點(diǎn)對應(yīng)的PYR濃度，PYR2表示按照當(dāng)前設(shè)定的參數(shù)和反應(yīng)速度推算下一點(diǎn)的PYR濃度；VNADH表示NADH濃度下降速度，KmNADH表示LDH對NADH的米氏常數(shù)，Kmpyr表示LDH對PYR的米氏常數(shù)，Kmab，表示兩個米氏常數(shù)的交叉項(xiàng)；dt為數(shù)值積分所用步長；當(dāng)用豬心LDH為工具酶時，上述參數(shù)定義和設(shè)置詳見J Biol Chem，1962；237(5)1668-1675。
(七)、當(dāng)所設(shè)定記錄的單一酶反應(yīng)過程數(shù)據(jù)對應(yīng)的最高底物濃度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范圍內(nèi)數(shù)據(jù)的平均速度仍然在經(jīng)典初速度法的線性范圍內(nèi)，則用經(jīng)典初速度法確定底物消耗低于10％范圍內(nèi)的平均速度為經(jīng)典初速度表示酶活性； (八)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到預(yù)設(shè)記錄總時間80％時(設(shè)定記錄時間為6分鐘則此時間為4.5分鐘左右)，如單一酶體系的底物消耗比例已經(jīng)高于積分法要求的下限(約40％)，則以最大反應(yīng)速度及初始底物濃度(或最大產(chǎn)物濃度、本底等相當(dāng)物理量)為參數(shù)，其余動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)固定為已知常數(shù)，用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程非線性擬合反應(yīng)曲線確定給出最好擬合的最大反應(yīng)速度為待測參數(shù)；當(dāng)偶聯(lián)一個工具酶的偶聯(lián)酶反應(yīng)體系的指示底物消耗已大于積分法要求的下限(約75％)時，則以待測酶反應(yīng)初速度和偶聯(lián)酶指示底物濃度為參數(shù)，用對應(yīng)數(shù)值積分速度方程(數(shù)值積分步長0.1秒)迭代擬合反應(yīng)曲線，達(dá)到最好擬合的待測酶反應(yīng)初速度為待測參數(shù)；此即用積分法測定的酶活性；積分法分析單一酶或偶聯(lián)酶反應(yīng)曲線測定酶活性要求的底物消耗比例隨著所用初始底物濃度相對于酶米氏常數(shù)的大小不同而不同，一般底物濃度越高則要求此底物消耗比例的下限越高。
(九)、對單一酶反應(yīng)體系，用其微分速度方程和原來設(shè)定的參數(shù)，將積分法所得最大反應(yīng)速度換算成所加初始底物濃度93％左右(波動在4％以內(nèi))初始底物濃度下的初速度，此即來自積分法的計(jì)算初速度；優(yōu)化最大反應(yīng)速度換算成初速度的初始底物濃度，使計(jì)算初速度對酶量的響應(yīng)曲線斜率同低酶活性時經(jīng)典初速度對酶量的響應(yīng)曲線斜率無統(tǒng)計(jì)差異，且在分析所設(shè)定記錄總時間80％內(nèi)底物消耗低于積分法要求的下限而在記錄總時間內(nèi)底物消耗比例達(dá)到積分法要求的下限的反應(yīng)曲線時，用積分法分析全部數(shù)據(jù)所得最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度后同經(jīng)典初速度法分析相同反應(yīng)曲線初始階段所得經(jīng)典初速度也無差異。
本發(fā)明的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是優(yōu)化單一酶反應(yīng)體系所用初始底物濃度、積分法所得最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度所需底物濃度和監(jiān)測反應(yīng)過程的時間，這樣才能使兩種方法的線性響應(yīng)曲線斜率相同，并保障存在兩種方法都能可靠測定的酶活性交叉區(qū)域，且在此區(qū)域內(nèi)兩種方法測定酶活性給出一致的結(jié)果。通常臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域分析一個標(biāo)本耗時5分鐘是基本可行的。因此，實(shí)踐中監(jiān)測反應(yīng)過程時間范圍是有限的，優(yōu)化反應(yīng)體系的初始底物濃度成為此聯(lián)用方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。反應(yīng)體系初始底物濃度越低則積分法所需底物消耗比例越高，且初始底物濃度太低會造成初速度法的線性響應(yīng)上限很低，除非顯著延長反應(yīng)記錄時間，就無法保障存在位于經(jīng)典初速度法線性上限和積分法實(shí)驗(yàn)可測線性響應(yīng)下限之間的酶活性區(qū)域(此即兩種方法都能測定酶活性的交叉區(qū)域)，但這會顯著降低分析效率。因此，雖然積分法可用很低的底物濃度，但當(dāng)兩種方法聯(lián)用時，初始底物濃度就不能太低，否則分析效率無法得到保障。在保障分析效率的前提下，通過優(yōu)化反應(yīng)體系的初始底物濃度和積分法所得最大反應(yīng)速度轉(zhuǎn)換成計(jì)算初速度所用的底物濃度，經(jīng)典初速度法和積分法可對酶量有相同的響應(yīng)曲線斜率；優(yōu)化監(jiān)測反應(yīng)的時間就可既保障分析效率，又使得存在兩種方法都有效的區(qū)域并能使兩種方法給出一致的酶活性指標(biāo)。這相當(dāng)于平面內(nèi)的兩條響應(yīng)直線斜率相同且有交點(diǎn)，實(shí)際上等于同一條直線，這是兩種方法能聯(lián)用測定酶活性獲得更高上限和更寬線性范圍的關(guān)鍵基礎(chǔ)。
因此，優(yōu)化初始底物濃度設(shè)置和監(jiān)測反應(yīng)過程的時間，有利于保障利用此聯(lián)用方法的可行性和可靠性，從而更高效率測定更寬線性范圍內(nèi)的酶活性。已實(shí)驗(yàn)明確此聯(lián)用方法可用于測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、淀粉酶、乳酸脫氫酶、尿酸酶等的活性，尤其對于單一酶反應(yīng)體系，只需要經(jīng)典積分法所需底物濃度的25％以下的初始底物濃度，就能以相同或相當(dāng)?shù)姆治鲂剩瑢⒕€性響應(yīng)范圍拓寬1倍以上。



圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中記錄的丁酰膽堿酯酶反應(yīng)曲線； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中聯(lián)用法測定的丁酰膽堿酯酶響應(yīng)曲線； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中記錄γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)曲線； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中聯(lián)用法測定γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶活性響應(yīng)曲線； 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3中記錄的谷丙轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)酶反應(yīng)曲線； 圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中聯(lián)用法測定的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性響應(yīng)曲線； 具體實(shí)施例 實(shí)施例1此聯(lián)用方法可測定人血清丁酰膽堿酯酶活性，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 (一)、在試管中加入50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)共0.90ml，及溶解在此磷酸鹽緩沖液中的硫代雙(2-硝基苯甲酸，Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)共0.10ml(終濃度0.50mmol/L)、適當(dāng)稀釋的血清樣品0.10ml，在30℃水浴恒溫5分鐘； (二)、加入溶解在上述磷酸鹽緩沖液中的底物硫代丁酰膽堿100μl到終濃度為54μmol/L，旋渦振蕩充分混勻； (三)、將反應(yīng)混合物迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)入比色杯，延遲15秒，以5秒間隔連續(xù)監(jiān)測410nm吸收變化，共監(jiān)測5.0分鐘，得到硫代但見與DTNB反應(yīng)產(chǎn)物吸收增加反應(yīng)曲線(附圖1)； (四)、將與前一個記錄數(shù)據(jù)相比光吸收增加不到0.002的數(shù)據(jù)去掉； (五)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行4.0分鐘后，如吸收增加到預(yù)期最大產(chǎn)物吸收增量的50％以上，就用單底物米氏酶的產(chǎn)物增加積分速度方程，以最大產(chǎn)物吸收(Am)和最大反應(yīng)速度(Vm)為參數(shù)，產(chǎn)物消光系數(shù)(ε)定在13.6(mmol/L)-1·cm-1，丁酰膽堿酯酶的米氏常數(shù)(Km)定在18.5μmol/L，用Visual Basic等編寫計(jì)算機(jī)程序，按如下以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程，對吸收變化數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后非線性擬合酶反應(yīng)曲線(瞬時吸收Ai隨時間t的變化曲線) -ln(Am-Ai)+Ai/(ε×Km)＝a+b×t[7] 對應(yīng)最好擬合的參數(shù)b乘以酶的米氏常數(shù)得到其最大反應(yīng)速度Vm。
(六)、按照相應(yīng)的單底物米氏酶微分速度方程和前述所用固定參數(shù)，設(shè)定底物為0.050mmol/L，將最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度； (七)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行4.0分鐘產(chǎn)物吸收還沒有增加到最大產(chǎn)物吸收理論值的50％時，分析反應(yīng)啟動后30秒到90秒之間的數(shù)據(jù)所得平均速度為經(jīng)典初速度表示酶活性； (八)、所述條件下，丁酰膽堿酯酶線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量為線性下限對應(yīng)酶量的100倍以上(附圖2)，但用經(jīng)典初速度法時線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量僅僅是下限對應(yīng)酶量的30倍；即使在2.0mmol/L的硫代丁酰膽堿為底物時，用經(jīng)典初速度法測定丁酰膽堿酯酶活性的線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量與線性下限對應(yīng)酶量也不超出50倍。
實(shí)施例2此聯(lián)用方法可測定小鼠腎臟或人血清中的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 (一)、在試管中加入含L-γ-谷氨酰對硝基苯胺110μmol/L、雙甘肽15.0mmol/L、MgCl210.0mmol/L的三羥基氨基甲烷-HCl緩沖液(100mmol/L，pH 8.1)共1.10ml；在30℃水浴恒溫5分鐘； (二)、取適當(dāng)稀釋樣品100μl加入上述試管內(nèi)，混勻使初始底物終濃度為100μmol/L； (三)、將反應(yīng)混合物迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)入比色杯，延遲15秒，以5秒間隔連續(xù)監(jiān)測405nm吸收變化，共監(jiān)測10.0分鐘，得到產(chǎn)物對硝基苯胺吸收增加的反應(yīng)曲線(附圖3)； (四)、將與前一個記錄數(shù)據(jù)相比光吸收增加不到0.002的數(shù)據(jù)去掉； (五)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行7.0分鐘后，如吸收增加到預(yù)期最大產(chǎn)物吸收的50％以上，就用單底物米氏酶的產(chǎn)物增加積分速度方程，以最大產(chǎn)物吸收(Am)、最大反應(yīng)速度(Vm)為參數(shù)，產(chǎn)物消光系數(shù)(ε)定在9.87(mmol/L)-1·cm-1，小鼠腎臟γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶對L-γ-谷氨酰對硝基苯胺的米氏常數(shù)(Km)定在0.96mmol/L，產(chǎn)物L(fēng)-γ-谷氨酰雙甘肽的抑制常數(shù)固定為0.25mmol/L，用計(jì)算機(jī)程序，按如下以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程，對吸收變化數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后非線性擬合γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶的反應(yīng)曲線(瞬時吸收Ai隨時間t的變化曲線) -Km×(Aki+Am-Ab)/Aki×ln(Am-Ai)+(1/ε-Km/Aki)×(Am-Ai)＝a+b×t [8] 對應(yīng)最好擬合的參數(shù)b為其最大反應(yīng)速度Vm。
(六)、按相應(yīng)單底物米氏酶微分速度方程和對應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，設(shè)定初始底物濃度為95μmol/L，將積分法所得最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度； (七)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行7.0分鐘產(chǎn)物吸收還沒有增加到預(yù)期最大產(chǎn)物吸收增量的50％時，分析反應(yīng)啟動后30秒到90秒之間的數(shù)據(jù)對應(yīng)的平均速度為經(jīng)典初速度； (八)、所述條件下，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性線性響應(yīng)上限為下限50倍以上(附圖4)，但用相同的初始底物濃度，經(jīng)典初速度法測定此酶活性的線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量也難超過線性下限對應(yīng)酶量的20倍；如用4.0mmol/L的L-γ-谷氨酰對硝基苯胺為底物，用經(jīng)典初速度法測定γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶活性的線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量與線性下限對應(yīng)酶量之比約40倍。
實(shí)施例3此聯(lián)用方法測定小鼠腎臟、人血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性的特征性步驟如下 (一)、在試管中加入含有600mmol/L丙氨酸、0.22mmol/L NADH，1400U/L LDH，100mmol/L Tris-HCl的L-γ-谷氨酰對硝基苯胺54μmol/L、雙甘肽15.0mmol/L、MgCl2為10.0mmol/L，含100mmol/L三羥基氨基甲烷-HCl的緩沖液(pH為7.3)共1.00ml；再加入100μl適當(dāng)稀釋的樣品，迅速混勻后在30℃恒溫5分鐘； (二)、加入16.3mmol/L的α-酮戊二酸溶液100μl到上述試管內(nèi)，快速振蕩混勻； (三)、將反應(yīng)混合物迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)入比色杯，延遲30秒，以1秒間隔連續(xù)監(jiān)測340nm吸收變化，共監(jiān)測5.0分鐘，得到指示底物(NADH)瞬時吸收(Ai)下降的反應(yīng)曲線(附圖5)； (四)、將與前一個記錄數(shù)據(jù)相比光吸收增加不到0.002的數(shù)據(jù)去掉； (五)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行4.0分鐘后，如指示底物吸收的下降高于理論值的70％，就以LDH活性和LDH的動力學(xué)參數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)為已知常數(shù)，本底吸收和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為未知參數(shù)，用偶聯(lián)酶反應(yīng)體系的數(shù)值積分速度方程，以0.1秒的積分步長，指示底物NADH的差毫摩爾消光系數(shù)(ε)定在6.22(mmol/L)-1·cm-1，迭代擬合ALT的偶聯(lián)酶反應(yīng)曲線 達(dá)到最好擬合的VALT為待測參數(shù)。其中，NADH1表示前一記錄點(diǎn)的NADH濃度，NADH2為據(jù)當(dāng)前丙酮酸(PYR)濃度、NADH濃度和LDH活性遞歸推算的下一記錄點(diǎn)的NADH濃度，PYR1表示前一記錄點(diǎn)的PYR濃度，PYR2表示按照當(dāng)前設(shè)定的參數(shù)和反應(yīng)速度推算的下一點(diǎn)PYR濃度；VNADH表示NADH濃度下降速度，KmNADH表示LDH對NADH的米氏常數(shù)，Kmpyr表示LDH對PYR的米氏常數(shù)，Kmab，表示兩個米氏常數(shù)的交叉項(xiàng)；dt為數(shù)值積分所用步長；當(dāng)用豬心肌LDH為偶聯(lián)的工具酶時，上述參數(shù)定義和設(shè)置詳見J Biol Chem，1962；237(5)1668-1675。對應(yīng)最好擬合的參數(shù)VALT為待測反應(yīng)速度Vm。
(六)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行4.0分鐘后指示底物吸收的下降仍然低于理論值的70％，則用經(jīng)典初速度法直接測定ALT活性。
(七)、所述條件下，聯(lián)用方法測定ALT活性的線性響應(yīng)上限對應(yīng)酶量為下限對應(yīng)酶量的30倍左右(附圖6)，線性上限達(dá)到110U/L以上；但用經(jīng)典初速度法時線性響應(yīng)上限小于50U/L，對應(yīng)酶量與線性下限對應(yīng)酶量之比僅15倍。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)用積分法和初速度法測定酶活性，從而用中等底物濃度和較高效率獲得更寬線性響應(yīng)范圍的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行
(一)、取一定量所需緩沖液加入試管內(nèi)，再加入一定量底物溶液，單一酶的單底物反應(yīng)體系初始底物濃度在待測酶米氏常數(shù)0.10到10倍之間，偶聯(lián)一個工具酶的反應(yīng)體系所需各種底物濃度及工具酶活性與用初速度法測定偶聯(lián)酶反應(yīng)體系酶活性時完全相同(即待測酶的底物濃度高于其米氏常數(shù)的10倍，偶聯(lián)工具酶活性盡可能高，指示底物濃度為檢測儀器線性響應(yīng)范圍的上限)；
(二)、將上述溶液混勻后在選定溫度(25～37℃)下恒溫5～10分鐘；
(三)、在上述溶液中加入待測酶液樣品，立即混勻，迅速將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到比色杯(或其它可連續(xù)監(jiān)測酶反應(yīng)過程的分析儀器的樣品室)；
(四)、延遲20秒，以1～60秒間隔監(jiān)測與底物或產(chǎn)物成比例的檢測信號(如光吸收)，共記錄3分鐘到10分鐘(偶聯(lián)酶反應(yīng)體系記錄間隔應(yīng)盡量短)；
(五)、數(shù)據(jù)過濾，去掉相鄰數(shù)據(jù)點(diǎn)中檢測信號變化小于儀器檢測噪聲2倍的數(shù)據(jù)(即去掉底物或產(chǎn)物濃度無顯著變化的數(shù)據(jù))，換算成底物或產(chǎn)物濃度隨時間變化的反應(yīng)曲線；
(六)、將單一酶單底物反應(yīng)微分速度方程積分成以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程，將偶聯(lián)一個工具酶的微分速度方程數(shù)值積分成以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程；如有底物或產(chǎn)物抑制則在積分速度方程中包含其抑制效應(yīng)；
(七)、在設(shè)定條件下，如所記錄反應(yīng)曲線中對應(yīng)的最高底物濃度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范圍內(nèi)數(shù)據(jù)的平均速度(即經(jīng)典初速度)仍低于初速度法的線性上限時，則用初速度法確定其經(jīng)典初速度表示酶活性；
(八)、當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到記錄總時間80％時(記錄總時間為6分鐘則此時間約4.5分鐘)，如單一酶單底物體系的底物消耗比例高于積分法所要求下限(一般約40％，初始底物濃度太低或太高時此底物消耗比例的下限更高)，則以最大反應(yīng)速度及初始底物濃度(或相當(dāng)?shù)膶?yīng)物理量)為參數(shù)，其余動力學(xué)參數(shù)固定為已知常數(shù)，用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程非線性擬合反應(yīng)曲線確定對應(yīng)的最大反應(yīng)速度，此即用積分法測定單一酶體系的酶活性；當(dāng)偶聯(lián)一個工具酶反應(yīng)體系指示底物消耗比例高于積分法所要求的下限(一般為75％，指示底物的濃度不同、工具酶的動力學(xué)參數(shù)不同時此底物消耗比例要求的下限也不同)時，則用待測酶反應(yīng)初速度和偶聯(lián)酶指示底物濃度為參數(shù)，用對應(yīng)的數(shù)值積分速度方程(數(shù)值積分步長0.1秒，盡可能短)迭代擬合酶反應(yīng)曲線，達(dá)到最好擬合的待測酶反應(yīng)初速度為待測參數(shù)，此即用積分法測定偶聯(lián)酶反應(yīng)體系的酶活性；
(九)、對單一酶反應(yīng)體系，用其微分速度方程和固定為常數(shù)的其它動力學(xué)參數(shù)，將積分法所得最大反應(yīng)速度換算成在所用反應(yīng)體系初始底物濃度93％(隨初始底物濃度變化，但波動在4％以內(nèi))底物濃度下的初速度，此即用積分法所得單一酶反應(yīng)體系的計(jì)算初速度；優(yōu)化最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度所用的底物濃度以同時滿足下列兩個要求(1)計(jì)算初速度對酶量的響應(yīng)曲線斜率同低酶活性范圍內(nèi)經(jīng)典初速度對酶量的響應(yīng)曲線斜率無統(tǒng)計(jì)差異，(2)對初速度法能可靠測定而此積分法也能可靠測定的酶活性交叉區(qū)域內(nèi)的樣品，用積分法所得的計(jì)算初速度同初速度法所得的經(jīng)典初速度也無統(tǒng)計(jì)差異。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于如步驟(七)到步驟(九)所述，當(dāng)單一酶反應(yīng)體系所記錄的反應(yīng)起始階段的底物濃度仍高于酶作用前的70％且對應(yīng)的經(jīng)典初速度仍在初速度法的線性范圍內(nèi)，則用初速度法測定經(jīng)典初速度表示酶活性；當(dāng)所設(shè)定記錄時間80％內(nèi)底物消耗比例已高于所用實(shí)驗(yàn)條件下積分法測定酶活性所要求的底物消耗比例下限，就用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程，以初始底物濃度(或最大產(chǎn)物濃度等相當(dāng)?shù)奈锢砹?、最大反應(yīng)速度為待測參數(shù)，其余所需動力學(xué)或熱力學(xué)參數(shù)為固定常數(shù)，非線性擬合酶反應(yīng)過程確定最大反應(yīng)速度，再按照步驟(九)所述換成成計(jì)算初速度表示酶活性；此特征不同于單用積分法測定酶活性。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于如步驟(一)中所述，對于單一酶反應(yīng)體系，此聯(lián)用方法所需底物濃度不需高于酶米氏常數(shù)的10倍而且變化范圍很寬，所需記錄反應(yīng)過程的總時間在3到10分鐘之間，就可獲得比經(jīng)典初速度法更高的線性響應(yīng)上限。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于如步驟(一)、步驟(六)到步驟(八)所述，對偶聯(lián)一個工具酶的反應(yīng)體系，此方法所需各種底物的濃度和工具酶活性同經(jīng)典初速度法測定偶聯(lián)酶反應(yīng)體系酶活性時相同，但當(dāng)所設(shè)定記錄時段80％時間內(nèi)底物消耗比例達(dá)到積分法的要求時，不用經(jīng)典初速度法測定初速度，而是用以反應(yīng)時間為自變量的數(shù)值積分速度方程迭代擬合偶聯(lián)酶反應(yīng)曲線確定待測酶反應(yīng)的初速度表示酶活性。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于如步驟(六)中所述，此聯(lián)用方法中所用積分速度方程以反應(yīng)時間為自變量，且當(dāng)反應(yīng)體系有底物或產(chǎn)物抑制時，在所用積分速度方程中還包含對應(yīng)的底物或產(chǎn)物抑制作用；此特征不同于經(jīng)典積分法和其它改進(jìn)方法。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與經(jīng)典初速度法測定酶活性的方法，其特征在于如步驟(九)中所述，用積分法獲得單一酶反應(yīng)體系最大反應(yīng)速度后，需優(yōu)化將最大反應(yīng)速度換算成計(jì)算初速度所需初始底物濃度，使積分法所得計(jì)算初速度對酶量響應(yīng)曲線斜率與初速度法響應(yīng)曲線斜率一致，且對初速度法與積分法都能可靠測定的酶活性樣品，兩種方法能給出無統(tǒng)計(jì)差異的結(jié)果；這是此聯(lián)用方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是不同于單用積分法測定酶活性的標(biāo)志。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于對偶聯(lián)酶反應(yīng)體系，直接將積分法和初速度法所測初速度聯(lián)用就可獲得更寬的線性響應(yīng)范圍；對單一酶反應(yīng)體系，需優(yōu)化將積分法所得最大反應(yīng)速度轉(zhuǎn)換成計(jì)算初速度的底物濃度，才可使此計(jì)算初速度對酶量響應(yīng)曲線斜率同經(jīng)典初速度對酶量響應(yīng)曲線斜率一致，且在積分法和初速度法都有效的范圍內(nèi)兩種方法所得酶活性一致，從而實(shí)現(xiàn)積分法與經(jīng)典初速度法的聯(lián)用。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)用積分法與經(jīng)典初速度法測定酶活性的方法，其特征在于此聯(lián)用方法要求所用測定條件下經(jīng)典初速度的線性上限高于積分法的可測下限，而此積分法的可測下限主要取決于監(jiān)測反應(yīng)過程的時間，同時受到所設(shè)初始底物濃度的影響；對偶聯(lián)酶反應(yīng)體系，優(yōu)化監(jiān)測反應(yīng)過程的時間是此聯(lián)用方法可行性的保障，對單一酶單底物反應(yīng)體系，優(yōu)化監(jiān)測反應(yīng)過程的時間和初始底物濃度是此聯(lián)用方法可行性的保障；積分法測定酶活性所需底物消耗比例下限取決于初始底物濃度與酶米氏常數(shù)的相對大小，及定量方法的靈敏度和精確度，初始底物濃度過高或過低時所需底物消耗比例下限升高，所需監(jiān)測反應(yīng)過程的時間延長，分析效率降低；監(jiān)測反應(yīng)過程所用定量方法的靈敏度和精確度越高，則此聯(lián)用方法測定酶活性所需底物濃度越低且監(jiān)測反應(yīng)時間越短；通常此聯(lián)用方法所需底物濃度在0.5倍到3.0倍酶米氏常數(shù)之間時所需監(jiān)測反應(yīng)過程時間最短，一般可不超過5分鐘，能保障常規(guī)分析的需要。
9.據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)用積分法與經(jīng)典初速度法測定酶活性的方法，其特征在于在所用實(shí)驗(yàn)測定條件下用此聯(lián)用方法測定酶活性，其線性響應(yīng)上限為積分法的線性響應(yīng)上限，線性響應(yīng)下限接近經(jīng)典初速度法的下限，但記錄反應(yīng)過程所需時間不多于10分鐘，底物濃度范圍寬，有成本和效率優(yōu)勢。
10.據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)用積分法與初速度法測定酶活性的方法，其特征在于對于多底物單一酶反應(yīng)體系，將某個底物濃度優(yōu)化為此聯(lián)用方法所需底物濃度，其余底物濃度在其10倍以上，則反應(yīng)可近似為單底物單一酶反應(yīng)，從而可應(yīng)用此聯(lián)用方法測定酶活性。
11.用此聯(lián)用方法可分析偶聯(lián)乳酸脫氫酶的人血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)過程測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，可測定丁酰膽堿酯酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶等的單一酶反應(yīng)體系的酶活性，可用于臨床檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)等領(lǐng)域。
全文摘要
一種聯(lián)用積分法和初速度法測定酶活性的方法；對單一酶反應(yīng)體系在低于米氏常數(shù)10倍的預(yù)設(shè)底物濃度下連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)3到10分鐘，當(dāng)起始底物濃度高于預(yù)設(shè)底物濃度70％且初速度仍在其線性范圍內(nèi)時測定經(jīng)典初速度，當(dāng)80％記錄時段內(nèi)底物消耗比例高于積分法所需下限時用以反應(yīng)時間為自變量的積分速度方程擬合反應(yīng)曲線確定最大反應(yīng)速度，再將最大反應(yīng)速度計(jì)算成預(yù)設(shè)底物濃度93％時的初速度，并使經(jīng)典初速度和計(jì)算初速度對酶量響應(yīng)曲線斜率相同；當(dāng)80％記錄時段內(nèi)偶聯(lián)酶反應(yīng)體系底物消耗比例高于積分法所需下限時用對應(yīng)的數(shù)值積分速度方程，迭代擬合酶反應(yīng)曲線確定初速度，否則直接測定經(jīng)典初速度；優(yōu)化監(jiān)測反應(yīng)的總時間是兩種方法聯(lián)用的保障。
文檔編號G01N21/17GK101173889SQ20071009308
公開日2008年5月7日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者飛 廖, 趙運(yùn)勝, 趙利娜, 巍 陸, 楊曉蘭, 紅 廖, 于明安, 宇 桑 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)