一種促進(jìn)還原力再生提高微生物羥化dhea轉(zhuǎn)化效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高濃度去氫表雄酮(DHEA)投料條件下促進(jìn)還原力再生來(lái)提高亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1羥化DHEA為7α，15α-羥基-去氫表雄酮(7α，15a-d1H-DHEA)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002 ]去氫表雄酮(DHEA)是由腎上腺分泌的一種腎上腺激素硫酸DHEA (DHEAS)的前體物質(zhì)，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面具有廣泛的藥理活性。DHEA可作為中間體合成許多具有重要生理活性的留體化合物，如7a，15a-di0H-DHEA是合成新型口服避孕藥“優(yōu)思明”的有效成分屈螺酮的前體化合物。由于7a，15a-di0H_DHEA具有重要的藥理作用和藥用價(jià)值，其市場(chǎng)前景十分可觀，因此如何提高底物DHEA投料濃度和7a，15a-di0H_DHEA產(chǎn)物得率成為當(dāng)前留體藥物領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。
[0003]目前，已從自然界中篩選得到多個(gè)具有羥化DHEA生成7a，15a-di0H_DHEA能力的菌株。其中，Colletotrichum I ini對(duì)DHEA輕化能力最強(qiáng)，在搖瓶培養(yǎng)條件下，底物投料濃度為10g/L時(shí)，7a，15a-di0H_DHEA得率能達(dá)到30%左右。但由于菌株轉(zhuǎn)化活性不高，高濃度底物對(duì)菌體毒害作用強(qiáng)等生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)問(wèn)題，造成轉(zhuǎn)化過(guò)程中底物投料濃度和產(chǎn)物7a，Ka-di OH-DHEA 得率都比較低 ，這些問(wèn)題直接成為7a，15a-di0H_DHEA工業(yè)生產(chǎn)中的瓶頸。留體的羥化反應(yīng)是利用了真核細(xì)胞線粒體膜上的細(xì)胞色素P450的單加氧酶活力，羥化反應(yīng)的反應(yīng)式如下:
[0004]底物+NADPH+02—產(chǎn)物+NADP++H20
[0005]由該反應(yīng)式可知，底物投料濃度、還原力的提供是影響留體羥化反應(yīng)效率的重要因素。留體羥化過(guò)程中，NADPH不斷被消耗，不能為羥化反應(yīng)提供足夠的還原力，從而直接影響羥化反應(yīng)的正常進(jìn)行。外源添加糖類(lèi)物質(zhì)，利用微生物自身代謝途徑促進(jìn)還原力NADPH再生，工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)適用。為了解決高濃度底物對(duì)菌體的毒害作用，提高產(chǎn)物7a，15a-di0H-DHEA得率，本專(zhuān)利建立了一種分批投加底物結(jié)合促進(jìn)還原力再生，適用于大規(guī)模生產(chǎn)的C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA的5L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種高濃度DHEA投料條件下促進(jìn)還原力再生來(lái)提高C.lini ST-1羥化DHEA生成7a，15a-di0H-DHEA的方法。本發(fā)明采用的生產(chǎn)菌株為2012年4月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏編號(hào)為CGMCC N0.650 I的亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum lini)ST_l，通過(guò)分批加入底物DHEA降低高濃度底物對(duì)菌體的毒害作用，同時(shí)補(bǔ)加適量的葡萄糖提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)還原力再生，最終實(shí)現(xiàn)高底物投料濃度、高底物高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)物得率的要求。
[0007]應(yīng)用上述微生物轉(zhuǎn)化DHEA生產(chǎn)7a，15a-di0H_DHEA的方法，其步驟如下:
[0008](I)采用保藏號(hào)為CGMCC N0.6501 的亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum lini)ST_l為生產(chǎn)菌種，25-40°C，120-220r/min條件下活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到PDA培養(yǎng)基上;
[0009](2)制備C.1ini ST-1菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物:挑取步驟(I)的I3DA固體培養(yǎng)基上的C.lini ST-1菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有20-50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25-40°C，置搖床上以120-220r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)18-30h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，即得到C.liniST-1菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；
[0010](3)5L發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng):將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以8-10% (v/v)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，裝液量為3L。在生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)溫度為25-400C，罐壓設(shè)為0.05MPa，轉(zhuǎn)速設(shè)為220-300r/min，通氣量為0.4-1.0vvm。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來(lái)控制發(fā)酵液中溶氧水平保持在10-20%，生長(zhǎng)12h后，即得到適宜于DHEA轉(zhuǎn)化的液體培養(yǎng)液；
[0011](4)底物分批投加工藝:精確稱(chēng)取三份5g/L粉末狀DHEA，于12h、16h、20h分別投入步驟(3)中的菌體培養(yǎng)液，使底物DHEA投料終濃度為15g/L，以降低高濃度底物的毒害作用。
[0012](5)促進(jìn)還原力再生工藝:轉(zhuǎn)化18h時(shí)，加入15g/L葡萄糖作為還原力再生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以促進(jìn)發(fā)酵液中還原力的再生。
[0013](6)DHEA生物轉(zhuǎn)化:在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，培養(yǎng)溫度為25_40°C，罐壓設(shè)為0.05MPa，通氣量為0.8-1.2vvm，轉(zhuǎn)速為300-450r/min，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來(lái)控制發(fā)酵液中溶氧水平保持在20-30%。通過(guò)發(fā)酵罐自動(dòng)流加40%的醋酸或10%的氫氧化鈉來(lái)維持轉(zhuǎn)化體系的pH為6.5，轉(zhuǎn)化30-48h，即得轉(zhuǎn)化液。
[0014](7)產(chǎn)物檢測(cè):將步驟(5)的轉(zhuǎn)化液在8000-12000r/min下離心5-10min，上清用等體積乙酸乙酯抽提7次，沉淀用適量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙腈復(fù)溶晶體并通過(guò)0.22μπι的有機(jī)膜過(guò)濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析7α，15a-di0H-DHEA 的含量。
[0015]其中步驟(I)中所述的PDA培養(yǎng)基的成分及配比為:土豆200-500g/L;葡萄糖20-50g/L;酵母粉2-10g/L;瓊脂粉10-20g/L;pH自然，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為:花生餅粉5_15g/L，葡萄糖20-50g/L;KCl l_5g/L;酵母粉10-30g/L；K2HPO4 0.1-5.0g/L；MgS04.7H20 0.l-5g/L；FeSO4.7H20 g/L;滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至6.5-7.5，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:葡萄糖20-50g/L;酵母粉10-30g/L;玉米漿3-10g/L;121°C高壓蒸汽下滅菌20min。步驟(4)所述補(bǔ)加葡萄糖成分及配比為:葡萄糖15g/L，121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0016]本發(fā)明所述利用亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum lini)ST_l轉(zhuǎn)化DHEA為7a，15a-d1H-DHEA的5L發(fā)酵罐工藝研究，首次將底物投料濃度提高至15g/L，并且能達(dá)到高底物轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)物得率的要求，此方法對(duì)微生物轉(zhuǎn)化留體化合物合成留體藥物中間體具有重要的借鑒意義。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1高底物投料條件下亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum lini)ST_l對(duì)DHEA的羥化過(guò)程研究。
[0018]圖2底物分批投加工藝對(duì)DHEA的羥化過(guò)程影響的研究。不同底物分批投料方式如下:A)精確稱(chēng)取三份5g/L粉末狀DHEA，分別于12、16、20h，分別投入菌體培養(yǎng)液，使底物DHEA投料終濃度為精確稱(chēng)取5g/L粉末狀DHEA，于12h投入菌體培養(yǎng)液，8h后投入10g/L底物，使底物DHEA投料終濃度為15g/L<X)精確稱(chēng)取10g/L粉末狀DHEA，于12h投入菌體培養(yǎng)液，8h后投入5g/L底物，使底物DHEA投料終濃度為15g/L。
[0019]圖3底物分批投料與促進(jìn)還原力再生工藝相結(jié)合的羥化策略對(duì)DHEA羥化過(guò)程影響的研究。該羥化策略如下:精確稱(chēng)取三份5g/L粉末狀DHEA，于12h、16h、20h分別投入的菌體培養(yǎng)液，使底物DHEA投料終濃度為15g/L。轉(zhuǎn)化18h時(shí)，加入15g/L葡萄糖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1高底物投料條件下亞麻刺盤(pán)孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1對(duì)DHEA的羥化反應(yīng)的研究
[0021](I)制備C.1ini ST-1細(xì)胞液體培養(yǎng)物
[0022]挑取PDA固體培養(yǎng)基上的C.liniST-1接種于裝有30mL新鮮液體種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C、120-220r/min培養(yǎng)24h。再以8-10%(v/v)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，裝液量為3L。在生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)溫度為25-40°C，罐壓設(shè)為0.05MPa，轉(zhuǎn)速設(shè)為220-300r/min，通氣量為0.4-1.0vvm，溶氧水平保持在10_20 %，生長(zhǎng)12h后，即得到適宜于DHEA轉(zhuǎn)化的液體培養(yǎng)液；
[0023](2)DHEA 輕化反應(yīng)
[0024]精確稱(chēng)取15g/L粉末狀DHEA，于12h投入步驟(I)中