專利名稱：：新漆酶和編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的漆酶。本發(fā)明的目的具體是提供新的漆酶、酶制劑以及編碼該酶的基因。本發(fā)明的另一目的是漆酶用于各種應(yīng)用中。漆酶(EC1.10.3.2)屬于藍(lán)銅氧化酶。根據(jù)定義，漆酶是對(duì)二酚氧化酶。除聯(lián)苯酚外，漆酶氧化許多其它底物，例如甲氧基取代的酚和二胺。關(guān)于它們的底物，漆酶是驚人的不確定。即由于它們廣泛的底物特異性，且另一方面，由于它們氧化酚類化合物的能力，漆酶在工業(yè)應(yīng)用中激起極大的興趣。前途有望的漆酶應(yīng)用領(lǐng)域包括，例如，森林工業(yè)中的脫木質(zhì)化作用和纖維板黏結(jié)，紡織工業(yè)中的織物染色和染坊廢水的解毒，也同樣應(yīng)用于不同的生物傳感器中。在介質(zhì)即中間分子的幫助下，漆酶也氧化那些它們否則將不能氧化的底物。這些介質(zhì)是被漆酶氧化的小分子化合物。這些被氧化的介質(zhì)反過來氧化那些真正的底物。第一種漆酶是早于1883年在日本漆樹(Rhusvernicifera)中發(fā)現(xiàn)的。漆酶在許多植物中被發(fā)現(xiàn)，例如桃樹、西紅柿、芒果和馬鈴薯；漆酶也在某些昆蟲中被發(fā)現(xiàn)。然而，大部分已知的漆酶源自白色的霉菌。例如下列屬產(chǎn)生漆酶蘑菇屬、曲霉屬、齒毛菌屬(Cerrena)、彎孢霉屬、鐮刀菌屬、Lentinius，Monocillium，Myceliophtora，鏈孢菌屬，青霉菌屬，白腐菌屬Phanerochaete、Phlebia、側(cè)耳屬真菌菇(Pleurotus)、Podospora、裂褶菌屬、孢子絲菌屬，殼多孢屬(Stagonospora)和采絨革蓋菌屬(Trametes)。在自然界中，漆酶的作用涉及木質(zhì)纖維素的分解、細(xì)胞壁的生物合成、水果和蔬菜的褐變反應(yīng)以及在預(yù)防微生物對(duì)植物的攻擊等。許多真菌的漆酶已經(jīng)被分離出來，編碼它們的某些基因已被克隆。例如，Saloheimo等(1985)分離并鑒定Phlebiaradiata的漆酶基因的特性，而Kojima等(1990)從白霉菌屬中分離了Coriolushirsutus的漆酶基因，以及Berka等(1997)在WO95/33836報(bào)道分離了Myceliophtorathermophila漆酶的基因。漆酶的天然生產(chǎn)水平經(jīng)常是很低的。通過在外源生產(chǎn)宿主中表達(dá)漆酶基因來改善生產(chǎn)已作了很大的努力。例如，Saloheimo和Niku-Paavola(1991；WO92/01046)成功地在reesei木霉真菌中生產(chǎn)了Phlebiaradiata漆酶。漆酶也已在米曲霉(Aspergillusoryzae)真菌(Yaver等，1996，Berka等，1997和WO95/33836)和畢赤酵母(Pichiapastorisyeast)(Jonsson等，1997)中異源地被生產(chǎn)出來。源于鬼傘屬的漆酶在曲霉屬真菌類的表達(dá)描述在專利公布WO97/08325中。相類似，源于Polyporuspinsitus的種的漆酶和源于柱霉屬的漆酶在曲霉屬真菌中的表達(dá)在專利公布US5,770,418和US5,843,745中分別被描述。分離自各種生物體的漆酶其溫度和pH特性各有不同。它們也依賴于所應(yīng)用的底物。由于大多數(shù)的漆酶已知在酸性pH和相當(dāng)?shù)偷臏囟认鹿δ茏罴?，它們的特性?duì)于應(yīng)用不是最佳的。某些熱穩(wěn)定或者中性的漆酶已有報(bào)道，但是通常，熱穩(wěn)定或者中性的漆酶或是熱穩(wěn)定的中是中性的，不會(huì)二者兼而有之。例如，Heinzkill等(1998)從鬼傘科屬(Coprinaceaegenus)的真菌中發(fā)現(xiàn)漆酶具有異常高的最適pH值。然而，60℃下60分鐘后，發(fā)現(xiàn)所有漆酶的活性從開始水平降至30％以下。已申請(qǐng)一項(xiàng)專利(WO96/06930)將這些漆酶在漂白紡織的染料中，但是這項(xiàng)應(yīng)用沒有提及高溫下這些漆酶的活性。此申請(qǐng)的實(shí)施例在30-35℃溫度下進(jìn)行。專利申請(qǐng)WO95/07988描述了源于立枯絲核菌屬真菌的一種天然漆酶，但是該申請(qǐng)除了堿性條件外沒有研究這種漆酶在高溫下的適用性。另一方面，專利申請(qǐng)WO98/55628描述了一種源于采絨革蓋菌(云芝)(Trametesversicolor)TV-1菌株的熱穩(wěn)定的漆酶，但是根據(jù)這項(xiàng)專利，該漆酶的活性在pH2時(shí)是最佳的。采絨革蓋菌(云芝)(Trametesversicolor)TV-1漆酶也不是pH穩(wěn)定的，在pH6下孵育60分鐘后其殘留活性大約是起初的60％。專利申請(qǐng)WO95/33836描述了中性的Myceliophtorathermophila漆酶，它在頭發(fā)染色中于pH7下起作用，但是該申請(qǐng)實(shí)施例中的溫度是30℃。Berka等(1997)出版報(bào)道了Myceliophtorathermophila漆酶在60℃下保留100％的活性達(dá)20分鐘，且其最佳活性是在pH6.5下。專利公布JP8070861和JP9056378詳細(xì)描述了Trametes漆酶，它們?cè)粓?bào)道是耐熱的以及它們的最適pH已報(bào)道是5.0。此外，Diamantidis等(2000)已鑒定了源于Azospirillumlipoferum細(xì)菌的細(xì)菌漆酶的特性。他們報(bào)道該漆酶在70℃下有10分鐘是耐熱的并且其最適pH是6.0。Bharathi和Ramalingam(1993)的公布描述了一種蛤蜊的酚氧化酶，它的最高活性在pH6.8下并且當(dāng)在60℃下孵化10分鐘時(shí)仍保留50％以上的活性。專利公布EP-A1-0852260描述了源于漆斑菌屬的種的多酚氧化酶，它們的最適pH值是8.5-9且最適溫度是在60-70℃之間。眾所周知，漆斑菌屬的真菌產(chǎn)生毒素。當(dāng)對(duì)各種酶所指定的最適溫度和pH值進(jìn)行比較時(shí)，應(yīng)注意到，所用的底物對(duì)值是有影響的。酚類底物，例如愈創(chuàng)木酚和syringaldazine，較非酚類底物如ABTS提供了更高的價(jià)值。下述的專利公布提示漆酶在木材加工應(yīng)用中的用途W(wǎng)O9954545，US5,691,193，DE4137761，EP408803和WO9523232。本發(fā)明的目的是消除涉及現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，并且提供一種相當(dāng)新的含有漆酶活性的酶制劑。尤其是，該酶制劑能用于要求耐受高溫和高pH的應(yīng)用中。例如，在木材加工工業(yè)和其它加工工業(yè)中就有這些應(yīng)用。本發(fā)明介紹一種新的漆酶，相對(duì)于在要求中性或者堿性pH值和超過40℃的溫度的應(yīng)用中的已知漆酶，它同時(shí)具有較好的溫度和pH特性，且特別是其耐熱穩(wěn)定性。為了更加精確，本發(fā)明的目的是權(quán)利要求1中所指定的漆酶。根據(jù)本發(fā)明該漆酶能從Melanocarpus屬的菌株中分離出來。就我們所知，從Melanocarpus屬菌株分離出的漆酶在此之前還沒有被詳細(xì)描述過。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶能優(yōu)選地從M.albomyces種的菌株，尤其是從IMI255989菌株中分離出來，其樣品可從CABI生物科學(xué)英國中心CABIGRC菌種保藏處(Egham)(BakehamLaneEghamSurreyDW209Ty，UK)免費(fèi)獲得。該菌株于1981年保藏在保藏中心。在1996年，該菌株也被保藏在VTT生物技術(shù)培養(yǎng)物保藏中心(芬蘭VTT技術(shù)研究中心，地址VTTBiotekniikka，PL1500，02044VTT，Espoo，F(xiàn)inland)，保藏編號(hào)為VTT-D-96490。此保藏樣品也可免費(fèi)獲得。這個(gè)菌株在出版物Ravanko(1996)中描述，它研究了在各種各樣的溫度和PH值下該菌株培養(yǎng)液的漆酶活性。然而，該出版物沒有描述此漆酶的分離和提純。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶大約在pH3-9在之間起作用，優(yōu)選4-8之間，更優(yōu)選5-8之間，甚至更優(yōu)選6-8之間，最優(yōu)選6.5-7.5之間。該漆酶活性在pH7-8最高，最高在約7.5。因此，此酶的最適pH值范圍十分廣，且范圍在pH5-7.5之間；優(yōu)選的最適pH是7.5。此酶的活性在30-80℃之間達(dá)最高，優(yōu)選40-80℃之間，更優(yōu)選50-80℃之間，甚至更優(yōu)選60-80℃之間，最優(yōu)選60-70℃之間。此酶的最佳活性出現(xiàn)在大約70℃的溫度。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶在高溫下可很好地保留其活性。在實(shí)施例3所述的條件下，其培養(yǎng)液中的該漆酶在60℃下孵育1小時(shí)后仍保留50％以上的活性。在70℃下孵育15分鐘后，該酶保留約30％的活性，以及在70℃下孵育30分鐘后，保留約10％的活性。80℃時(shí)，在實(shí)施例3所述的條件下該酶經(jīng)得起孵育約5分鐘。在某些應(yīng)用中，例如，在森林工業(yè)中，即使一段短時(shí)間內(nèi)的高溫耐受也提供相當(dāng)大的好處。當(dāng)進(jìn)一步研究純酶的活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)此酶的熱穩(wěn)定性是異常地好，且無疑地好于先前所描述的漆酶的熱穩(wěn)定性。在60℃下，此酶保留其活性基本上2小時(shí)無改變，正如實(shí)施例3和圖7所顯示。由Berka等(1997)鑒定特征的Myceliophtora漆酶的熱穩(wěn)定性在60℃下只保留20分鐘。此外，當(dāng)pH值增加時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的pH穩(wěn)定性有所改善。在pH4下孵育22小時(shí)后，其殘留活性為65％，在pH5下的同等條件中其殘留活性大約為80％，在pH6下其殘留活性大約為85％，在pH7下其殘留活性約為90％，以及在pH8時(shí)超過90％，約為92％。與最適pH值一起，此特性使得它有益于在高pH值下應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明所述的酶。本發(fā)明所述的漆酶當(dāng)?shù)入娋劢箿y(cè)量時(shí)其等電點(diǎn)大約是4.0，由此精確度大約為±0.5。當(dāng)用SDS-PAGE來確定時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的分子量大約是80kDa。SDS-PAGE精確度在±5kDa范圍內(nèi)。本發(fā)明的目的具體是漆酶，當(dāng)它被提純時(shí)，等電聚焦測(cè)量其等電點(diǎn)約為4.0，以及分子量約為80kDa。而當(dāng)以提純的酶來測(cè)量時(shí)此漆酶的最適pH約是7.5，以及最適溫度約是70℃。此漆酶可分離自Melanocarpus屬的菌株，優(yōu)選分離自Melanocarpusalbomyces屬的菌株，最優(yōu)選分離自M.albomycesIMI25598菌株。本發(fā)明的另一目的是分離并純化的漆酶。本發(fā)明進(jìn)一步目的是含有根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的酶制劑。此酶制劑中漆酶的含量?jī)?yōu)選高于Melanocarpus屬的菌株尤其是Melanocarpusalbomyces種的菌株中的含量，特別是由M.albomycesIMI255989菌株在生長(zhǎng)條件中其培養(yǎng)液里天然產(chǎn)生的酶含量，這些生長(zhǎng)條件對(duì)于生產(chǎn)漆酶不是最優(yōu)化的。此酶制劑中漆酶的含量?jī)?yōu)選高于10mg/l，更優(yōu)選≥30mg/l，甚至更優(yōu)選≥300mg/l，仍然甚至更優(yōu)選≥500mg/l；最優(yōu)選≥1g/l。如上所述，根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶可分離自Melanocarpus屬的菌株，特別是分離自Melanocarpusalbomyces種的菌株，尤其是分離自M.albomycesIMI255989菌株，但是它也能通過分離編碼根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的基因并將它們轉(zhuǎn)移入合適的生產(chǎn)宿主以重組技術(shù)來進(jìn)行生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶可在其天然宿主或生產(chǎn)宿主的培養(yǎng)液中生產(chǎn)，從這些宿主中通過運(yùn)用已知的蛋白化學(xué)方法它能被分離和提純。如果此培養(yǎng)液含有足夠高含量的漆酶，而且沒有其它有害的蛋白質(zhì)，則此培養(yǎng)液通過簡(jiǎn)單的分離細(xì)胞就可被如此使用。此培養(yǎng)液可能被濃縮。在不同的應(yīng)用中，優(yōu)選使用包含含量增加的漆酶的酶制劑。漆酶增加的含量通過在生產(chǎn)宿主的培養(yǎng)液中以重組技術(shù)方法能被制備。此增加的含量參考漆酶含量，其超過Melanocarpus屬的菌株，特別是Melanocarpusalbomyces屬的菌株，尤其是IMI255989菌株天然生產(chǎn)的漆酶含量。本發(fā)明另外的目的是含有必需含量的根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的酶制劑。這意味著此漆酶是沒有任何相當(dāng)含量的其它酶的酶制劑的主要活性。本發(fā)明另外的目的物也是一種酶制劑，它含有可從Melanocarpus屬的真菌中分離的漆酶，和各自應(yīng)用所需的添加劑。這些添加劑能包含，例如，緩沖劑和穩(wěn)定劑。本發(fā)明的目的也是編碼漆酶的核酸分子。此核酸分子選自-一種核酸分子，其包含如SEQIDNO1或圖15中所描述的核苷酸序列的編碼區(qū)；-一種核酸分子，其編碼含有如SEQIDNO2或圖15中所描述的氨基酸序列的多肽；-一種核酸分子，其包含由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而區(qū)別于SEQIDNO1或圖15中所描述的核苷酸序列的編碼序列；-一種核酸分子，其與SEQIDNO1或圖15的核苷酸序列雜交；-一種核酸分子，其編碼多肽，所述多肽具有漆酶活性以及其氨基酸序列與SEQIDNO2或圖15的氨基酸序列比較顯示至少73％的同一性。本發(fā)明也包括了編碼多肽的核酸分子，其氨基酸序列與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列比較顯示至少75％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少85％的同一性，甚至更優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選至少95％的同一性。如果根據(jù)本發(fā)明所述多肽的氨基酸序列與IDNO2或圖15的氨基酸序列比較顯示至少99％的同一性，這是最優(yōu)選的。如果相似性在同源氨基酸基礎(chǔ)上被評(píng)估，本發(fā)明包括了核酸分子，其編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列至少83％同源于SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列，優(yōu)選至少85％同源，更優(yōu)選至少90％同源，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％同源于SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列。此發(fā)明也包括了核酸分子，其在雜交條件下與序列SEQIDNO1雜交，其中雜交溶液含有6XSSC、5XDenhadt試劑、0.5％SDS、100μg/ml變性DNA，并且雜交在50-60℃下進(jìn)行。另一選擇方法是雜交溶液含有6XSSC、5XDenhadt試劑、0.5％SDS、100μg/ml變性DNA、50％甲酰胺，在此情況下，在25-35℃下實(shí)施雜交。此發(fā)明尤其包括了那些核酸分子，其在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1序列雜交，由此根據(jù)第一種選擇方法進(jìn)行雜交，否則在同等條件，但是在68℃下雜交，以及根據(jù)第二種選擇方法，在42℃雜交。5×Denhadt是10g/l菲科爾、10g/l聚乙烯吡咯烷酮、10g/l牛血清白蛋白和SSC是0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉鹽、pH7.0。核酸分子涉及DNA、RNA或者例如cDNA。本發(fā)明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定義的核酸分子所編碼。本發(fā)明進(jìn)一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列是相同或者同源的。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)漆酶的方法，其包含以下步驟-將根據(jù)此發(fā)明所述的核酸分子或者載體轉(zhuǎn)移到微生物宿主細(xì)胞中以表達(dá)核酸分子和任選地從宿主細(xì)胞中分泌所表達(dá)的肽；以及-具有漆酶活性的多肽或從微生物宿主的細(xì)胞或從微生物宿主的培養(yǎng)液中回收。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶格外適合于工業(yè)應(yīng)用，在其中占優(yōu)勢(shì)的pH和溫度條件是高的。這些應(yīng)用包括森林工業(yè)，其影響木質(zhì)素或者提取物(或直接地或通過介質(zhì))，從機(jī)械磨碎的含木質(zhì)素的纖維中的制造纖維產(chǎn)品和木板，造紙機(jī)器運(yùn)行性能的改善和其它應(yīng)用，聚合物的氧化，例如木質(zhì)素、纖維素和或者淀粉(或直接地或通過介質(zhì))，以及其它化學(xué)品的氧化，例如烯烴或者有色分子。在這些應(yīng)用中，溫度經(jīng)常高于60℃，一般高至80℃，且pH值接近于中性或者稍高些。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶在pH值和溫度都同時(shí)相當(dāng)高的條件下作用極好。以下，在附圖和實(shí)施例的幫助下將詳細(xì)描述本發(fā)明。圖1顯示搖瓶培養(yǎng)中M.albomyces漆酶的生產(chǎn)。圖2顯示在陰離子交換層析中各種餾分的漆酶活性和蛋白質(zhì)含量。圖3顯示在疏水作用層析中各種餾分的漆酶活性和蛋白質(zhì)含量。圖4顯示M.albomyces漆酶活性對(duì)溫度的依賴性。圖5顯示M.albomyces漆酶在各種pH值下的活性。圖6顯示M.albomyces漆酶在各種溫度下的殘留活性。圖7顯示純的M.albomyces漆酶在各種溫度下的殘留活性。圖8顯示M.albomyces漆酶在各種pH值下經(jīng)22小時(shí)孵育后的殘留活性。圖9顯示40℃時(shí)在各種pH值下M.albomyces和T.hirsuta漆酶從2，6-二甲氧基酚中形成顏色的能力。漆酶含量是15nkat/mmol底物。圖10顯示60℃時(shí)在各種pH值下M.albomyces和T.hirsuta漆酶從2，6-二甲氧基酚中形成顏色的能力。漆酶含量是30nkat/mmol底物。圖11顯示在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下織物染色的脫色作用。圖12顯示于40℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的聚合作用。圖13顯示于60℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的聚合作用。圖14顯示于70℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下源自木質(zhì)素和提取物的可溶性化合物的聚合作用。圖15顯示編碼Melanocarpusalbomyces漆酶的基因和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。用于此申請(qǐng)的術(shù)語“酶制劑”指的是包含漆酶活性的任何產(chǎn)品。酶制劑能是，例如，包含漆酶的培養(yǎng)液、分離的漆酶或者酶混合物，其中至少一種成分是漆酶。酶制劑也可包含各種添加劑，例如穩(wěn)定劑或者緩沖劑。它們被挑選是為了適合于漆酶制劑的各自應(yīng)用。酶制劑也能包含其它的酶活性，例如過氧化物酶活性，這取決于酶制劑的應(yīng)用。含有漆酶的酶制劑也能包含合適的介質(zhì)，它被用于增強(qiáng)漆酶的作用。合適的介質(zhì)包括，例如，Tempo(＝2，2，6，6-四甲基-1-呱啶基氧)、HBT(1-羥基苯并三唑)、ABTS＝2，2’-連氮基雙-3-乙基苯基噻唑-6-磺酸酯、紫尿酸)、NHA(＝N-羥基-乙酰苯胺)。生產(chǎn)漆酶的微生物的篩選生產(chǎn)漆酶的微生物能從自然界中分離出來或者通過微生物學(xué)中熟知的篩選方法從已分離且鑒定的培養(yǎng)收集的菌株中篩選。由于漆酶屬于酚氧化酶，那些適于篩選酚氧化酶的方法用于篩選中?；蛟谄桨迮囵B(yǎng)的固體培養(yǎng)上或在液體培養(yǎng)基中通過測(cè)量酶活性研究酶的產(chǎn)生從而進(jìn)行篩選。在尋找較大多數(shù)已知的漆酶耐受更高的溫度和pH的新漆酶時(shí)，從環(huán)境中篩選微生物是值得的，其中它們生活在溫暖和/或堿性條件下。這樣的環(huán)境被發(fā)現(xiàn)，例如，在堆肥、木屑堆或者熱帶地區(qū)。通過在菌絲頂端添加酚氧化酶的底物，在平板中可對(duì)在篩選中所發(fā)現(xiàn)的陽性真菌酚氧化酶的生產(chǎn)進(jìn)行研究。通過應(yīng)用這些點(diǎn)滴測(cè)定，可發(fā)現(xiàn)平板上的陽性反應(yīng)是否是酚氧化酶或漆酶引起的。合適的試劑包括ABTS、syringaldazine和愈創(chuàng)木酚，且在觀察的過氧化物酶、過氧化氫。將產(chǎn)生酚氧化酶且作為篩選結(jié)果而被發(fā)現(xiàn)的微生物在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中酚氧化酶的形成由適于測(cè)量酚氧化酶活性的方法來觀測(cè)。對(duì)真菌合適的培養(yǎng)基包括，例如，麥芽提取物和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，以及用來測(cè)量活性的合適底物包括ABTS、愈創(chuàng)木酚和syringaldazine。對(duì)于許多真菌，酚氧化酶的產(chǎn)生要求誘導(dǎo)劑。這些誘導(dǎo)劑包括，例如，芳香族化合物、含有木質(zhì)素的材料、表面活性劑、某些碳源和硫酸銅。漆酶活性能通過采用ABTS作為底物被測(cè)量，漆酶將它氧化為暗綠色。此測(cè)量可根據(jù)Niku-Paavola等(1988)的方法來實(shí)施。漆酶活性也可根據(jù)Paszczynnski等(1985)的方法通過使用愈創(chuàng)木酚來測(cè)定。在足量的目的漆酶被生產(chǎn)出后，此酶被純化且它的特性被鑒定出來。此酶的溫度和pH值以及等電點(diǎn)能被確定。漆酶生產(chǎn)者也能通過漆酶基因序列的同源性來篩選。如果是那樣的話，基于漆酶基因氨基端的保守區(qū)域的核苷酸能作為引物用于PCR中，然后例如在各種真菌基因組中尋找基因序列，這些基因序列與已知漆酶同源。漆酶活性在不同溫度下的確定能通過ABTS方法來完成，如實(shí)施例1中所述。在不同的pH值下和合適的緩沖劑中此漆酶的最適pH值能通過愈創(chuàng)木酚方法來確定。當(dāng)pH值超過7時(shí)，在活性分析中ABTS的作用變?nèi)酢Ｆ錈岱€(wěn)定性能通過在不同溫度、確定的pH值和適宜的緩沖劑下孵育酶樣品來確定。各溫度下此酶殘留活性能通過、例如、ABTS方法來解釋。在不同的pH值下和合適的緩沖劑中其pH穩(wěn)定性能通過孵育酶樣品來確定。其殘留活性能通過例如ABTS方法來確定。漆酶的分離和純化此酶能通過應(yīng)用常規(guī)的酶化學(xué)方法來提純，例如鹽析、超濾、離子交換層析法和疏水作用層析法。提純能通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來監(jiān)測(cè)?？稍诓煌瑴囟群蚿H值下對(duì)純化的酶活性進(jìn)行測(cè)定；同樣，可對(duì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明的實(shí)施例中，漆酶生產(chǎn)被描述成在豐富培養(yǎng)基上培養(yǎng)Melanocarpusalbomyces菌株。在培養(yǎng)期間，根據(jù)Niku-Paavola等(1988)的ABTS方法基于在漆酶作用下從ABTS中生成暗綠色陽離子自由基對(duì)漆酶活性進(jìn)行監(jiān)控。然而，本發(fā)明不僅限于在這種培養(yǎng)基上產(chǎn)生的M.albomyces漆酶。M.albomyces漆酶的純化來自培養(yǎng)液，來自通過過濾或離心除去細(xì)胞的培養(yǎng)液。采用超濾使培養(yǎng)液進(jìn)一步濃縮。陰離子交換層析法和疏水作用層析法被用于進(jìn)一步提純。超濾中的截留分子量值大約是30kDa。陰離子交換層析法在pH5乙酸鹽緩沖液中完成，并用遞增的線性梯度的硫酸鈉從柱中將該漆酶洗脫出來。離子交換后最佳的餾分通過疏水作用層析在pH5乙酸鹽緩沖液中進(jìn)一步被提純。樣品在0.7M硫酸鈉濃度下結(jié)合并用遞減的線性梯度的硫酸鈉洗脫。然而，通過使用其它已知的提純方法分離此酶也是可能的。提純的M.albomyces漆酶的分子大小、等電點(diǎn)以及pH和溫度分布圖被確定。提純的酶指的是酶制劑，其除漆酶帶外沒有其它的蛋白質(zhì)，其可被觀察，如通過SDS-PAGE和考馬斯染色法所確定。在此申請(qǐng)中，酶通過超濾法、陰離子交換層析法和疏水作用層析法被提純。基本上不含有其它蛋白質(zhì)的所獲得的漆酶純度是≥90％。提純的M.albomyces漆酶的分子大小是80kDa，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳確定。在采用MultiphorII電泳設(shè)備(PharmaciaLKB)的等電聚焦中，等電點(diǎn)確定為4.0。M.albomyces漆酶的活性在溫度70℃時(shí)最高和其最適pH是7.5。經(jīng)60℃下孵育兩小時(shí)后，M.albomyces漆酶仍保留100％的活性。而且，當(dāng)pH值增加時(shí)，它的pH穩(wěn)定性有所改善。漆酶的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶能在其天然宿主或生產(chǎn)宿主的培養(yǎng)液里被生產(chǎn)出來，從該培養(yǎng)液中通過應(yīng)用已知蛋白質(zhì)化學(xué)方法可將它分離和提純。如果培養(yǎng)液含有足夠高含量的漆酶而不含其它的有害蛋白質(zhì)，通過簡(jiǎn)單分離細(xì)胞就應(yīng)用此培養(yǎng)液也是可能的。當(dāng)需要如此時(shí)，可將培養(yǎng)液濃縮和/或提純。在不同的應(yīng)用中，利用含有含量增加的漆酶的酶制劑是更可取的。這樣的酶制劑的制備方法是以基因技術(shù)的方法從生產(chǎn)宿主的培養(yǎng)液中生產(chǎn)含量增加的漆酶。此增加的含量指的是漆酶的含量，它超過了由M.albomyces菌株特別是菌株IMI255989天然生產(chǎn)的漆酶含量。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也能采用重組技術(shù)通過分離編碼根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶的基因并將它們轉(zhuǎn)移到合適的生產(chǎn)宿主中來進(jìn)行生產(chǎn)。該編碼漆酶的基因能從cDNA文庫中以下列任何方式分離。此cDNA文庫可在合適的酵母表達(dá)載體中構(gòu)建并且轉(zhuǎn)化到例如釀酒酵母中。生產(chǎn)漆酶的克隆例如根據(jù)通過應(yīng)用包含ABTS底物的平板而測(cè)定的活性被鑒定。另一可能性是將cDNA文庫連接到λZAP載體上并感染帶有獲得的生產(chǎn)庫的大腸桿菌細(xì)胞。編碼漆酶的克隆或在多克隆抗體或在DNA雜交的幫助下被確認(rèn)。如果使用多克隆抗體，它們被生產(chǎn)以抗例如兔中提純的漆酶蛋白。在雜交中，由PCR提供的漆酶基因片段作為一種探針應(yīng)用。如果是那樣的話，PCR引物序列或以漆酶基因中一般保守的區(qū)域(例如，與活性中心的氨基酸相對(duì)應(yīng)的區(qū)域)為基礎(chǔ)或以提純的漆酶蛋白質(zhì)或內(nèi)肽的氨基末端的序列為基礎(chǔ)。此外，與各信使RNA尾部的多腺嘌呤區(qū)域結(jié)合的oligodT區(qū)域能作為PCR引物而應(yīng)用。分離的漆酶cDNA被測(cè)序。分離的cDNA和分離的酶之間的關(guān)系通過氨基酸測(cè)序能被確定，該氨基酸序列是由酶形成的。漆酶基因的染色體拷貝或能通過PCR分離或能從λ載體中的基因組文庫中被分離，且內(nèi)含子的定位能通過測(cè)序被建立。M.albomyces漆酶基因的分離根據(jù)信使RNA和cDNA文庫，M.albomyces漆酶基因的分離是不可能的。創(chuàng)建由代表性的cDNA文庫不是成功的。令人驚奇地是由M.albomyces在培養(yǎng)晚期生產(chǎn)漆酶的事實(shí)引出問題，當(dāng)許多細(xì)胞早已自溶，以及信使RNA部分降解時(shí)，則分離純的RNA是困難的。因此，代替此cDNA文庫，基因不得不從基因組基因庫中分離?；虻姆蛛x在實(shí)施例9中有詳細(xì)描述。漆酶基因序列在圖15和序列表(SEQIDNO1)中顯示。基因的長(zhǎng)度是2279bp，包括內(nèi)含子。如圖15所示，開始編碼區(qū)的堿基數(shù)是286，其內(nèi)含子位于第541-618、第698-770、第783-869、第1913-1999和第2069-2150。最終編碼堿基是第2561。該基因編碼長(zhǎng)度為623個(gè)氨基酸的多肽。當(dāng)采用Blast方法(Altschul等，1990)將該氨基酸序列與在專利申請(qǐng)WO9533836中公開的Myceliophtora的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列72％是完全一致的(同一性450/623，72％)，并82％是同源的(陽性518/623，82％；陽性指的是同源性氨基酸)，(間隙＝4/623，0％)。當(dāng)對(duì)Podosporaanserina漆酶進(jìn)行相應(yīng)比較時(shí)(Fernandez-Larrea和Stahl，1996)，發(fā)現(xiàn)其序列68％是完全一致的(一致性427/627，68％)，并且79％是同源的(陽性502/627，79％)(間隙＝12/627，1％)。分離的漆酶基因被用在其它生物體中生產(chǎn)蛋白。這樣的生產(chǎn)宿主包括上面所提及的曲霉生產(chǎn)系統(tǒng)，例如米曲霉(A.oryzae)或者黑曲霉(A.niger)(US5,843,745，US5,770,418，WO9708325和WO9533386)、由木霉屬真菌(EP244234)而發(fā)展的生產(chǎn)系統(tǒng)、或者由鐮孢菌屬真菌種而發(fā)展的生產(chǎn)系統(tǒng)，例如尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)(Malardier等，1989)、由芽孢桿菌屬細(xì)菌而發(fā)展的生產(chǎn)系統(tǒng)，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或者大腸桿菌、酵母屬酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或者畢赤酵母、或者鏈霉菌放線菌或者某些其它微生物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)化漆酶生產(chǎn)漆酶生產(chǎn)的提高方法是優(yōu)化野生或重組菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。當(dāng)優(yōu)化培養(yǎng)基時(shí)，例如，氮源質(zhì)量(其中，有機(jī)或無機(jī)氮源)和數(shù)量對(duì)漆酶生產(chǎn)的影響。當(dāng)需要時(shí)，為了達(dá)到更高的產(chǎn)量氮源受到限制。同樣，碳源的影響被確立。最適于酶生產(chǎn)的碳源被挑選。當(dāng)需要時(shí)，碳源的量也能受到限制。碳/氮比例被優(yōu)化到最適于酶生產(chǎn)。生長(zhǎng)環(huán)境被優(yōu)化到最可能適于正在討論中的酶生產(chǎn)。微生物在最適于酶生產(chǎn)的pH和溫度下生長(zhǎng)。適當(dāng)?shù)幕旌虾涂諝夤┙o在發(fā)酵過程中保證最適通風(fēng)。在發(fā)酵中，漆酶生產(chǎn)的誘導(dǎo)劑，例如3，4-二甲氧苯甲基乙醇、二甲苯酸或者木質(zhì)素也能被應(yīng)用。添加誘導(dǎo)劑的方法和時(shí)間以及它們的濃度被優(yōu)化。漆酶在各種應(yīng)用中的用途通常，根據(jù)本發(fā)明的漆酶是十分適宜于在應(yīng)用領(lǐng)域中被使用，其中漆酶能被使用，例如凝膠形成、纖維黏結(jié)、栓處理脫色(尤其織物染色)、纖維染色、蛋白處理、去污劑、抗微生物應(yīng)用、淀粉應(yīng)用、化學(xué)品的氧化、生物膜的去除、木質(zhì)素衍生物的制備、醫(yī)學(xué)分析、減少羊毛縮水、烘烤、改善啤酒的保存性能、染料生產(chǎn)、油產(chǎn)品中氧的去除以及碘的生產(chǎn)。當(dāng)需要如此時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也能因確定的目的而被固定。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶尤其十分適宜于工業(yè)應(yīng)用，其中占優(yōu)勢(shì)的pH和溫度條件是高的。其中，這樣的應(yīng)用包括森林工業(yè)的應(yīng)用、從機(jī)械磨碎的含有木質(zhì)素的纖維中制造纖維產(chǎn)品和木板、造紙機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)性能的改善和其他應(yīng)用、聚合物的氧化和其它化學(xué)品例如染料分子的氧化。在這些應(yīng)用中，溫度經(jīng)常超過60℃，通常達(dá)80℃，且pH值臨近中性或者輕微堿性。在所有應(yīng)用中，足夠的氧用于反應(yīng)是必需的。氧是漆酶需要的還原底物。在某些情況下，尤其當(dāng)?shù)孜餄舛鹊蜁r(shí)，反應(yīng)混合物中如此能有足夠的氧，但它也能或通過引入空氣或通過引入氧或富含氧的空氣被加到反應(yīng)混合物中。當(dāng)需要時(shí)，介質(zhì)在反應(yīng)中被用作添加劑。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶是十分適宜于例如著色劑的氧化。染料分子被引入在pH4-8下與漆酶接觸，例如在pH4.5-7.5下，優(yōu)選在pH6-8，更優(yōu)選在pH7-8，其溫度在25-80℃范圍內(nèi)，優(yōu)選40-80℃，更優(yōu)選50-80℃，最優(yōu)選60-80℃。氧按需要被加進(jìn)反應(yīng)中。漆酶含量是每克著色劑的1-1000nkat，優(yōu)選10-500nkat，最優(yōu)選20-200nkat。此反應(yīng)被允許發(fā)生5分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選30分鐘-2小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也十分適宜于聚合作用。有待聚合的挑選的化合物被引入在上述相同條件下與漆酶接觸。在實(shí)驗(yàn)過程中，此反應(yīng)混合物也能被通入空氣。聚合作用能通過跟蹤聚合化合物分子量的增加而被監(jiān)測(cè)，例如通過GPC(凝膠滲透層析法)。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也能用于改善造紙機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)性能。通過源于木質(zhì)素和提取物的化合物聚合和通過在造紙機(jī)器中有害微生物的生長(zhǎng)降低，漆酶也能用于改善造紙機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)性能。通常，在造紙機(jī)器中的條件是pH約5-7和溫度60-80℃。漆酶能被加進(jìn)處理水或者造紙機(jī)器的頭箱或者循環(huán)水系統(tǒng)中，而基本上無需改變?cè)谠旒垯C(jī)器中占優(yōu)勢(shì)的條件。pH能在5-8范圍內(nèi)以及溫度在50-80℃范圍內(nèi)。漆酶含量能是每克干物質(zhì)、纖維或每升循環(huán)水的1-1000nkat，優(yōu)選10-500nkat。處理時(shí)間能是5分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選30分鐘-2小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也能用于纖維的氧化。含木質(zhì)素的纖維能被引入在溫度50-80℃、甚至高達(dá)50-100℃，優(yōu)選在溫度60-80℃，pH5-8，優(yōu)選pH6-8下與漆酶接觸，漆酶濃度以每克纖維的1-1000nkat，優(yōu)選10-500nkat，反應(yīng)時(shí)間是2分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-2小時(shí)。由于漆酶處理，纖維的強(qiáng)度特性改善，它能被利用例如在纖維木板如MDF木反的制造中，或者在紙產(chǎn)品或紙板產(chǎn)品中，這些產(chǎn)品是由機(jī)械磨碎的含木質(zhì)素的纖維構(gòu)成的。除了上面所提及的申請(qǐng)實(shí)施例外，根據(jù)本發(fā)明所述的漆酶也能被用于纖維的脫木質(zhì)化作用中?？蓪⑵崦附佑|那些有待脫木質(zhì)素的纖維，例如牛皮紙纖維，其卡帕值為20-30，優(yōu)選大約25，密度為5-15，優(yōu)選約10％，優(yōu)選有介質(zhì)存在，其量為紙漿的1-5％，優(yōu)選為紙漿的3％，pH5-8范圍內(nèi)，優(yōu)選pH6-8內(nèi)，溫度在50-80℃范圍內(nèi)，優(yōu)選60-80℃范圍內(nèi)。反應(yīng)時(shí)間能在5分鐘-24小時(shí)之間，優(yōu)選30分鐘-2小時(shí)。漆酶含量在0.5Mpa的氧壓下可為10-1000nkat/g，優(yōu)選10-500nkat/g。下面的實(shí)施例目的是對(duì)本發(fā)明的說明，且不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明。葡萄糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌。首先，在100ml培養(yǎng)基中接種3-4塊(約1cm2)切割自在麥片瓊脂上生長(zhǎng)良好的菌絲體。其培養(yǎng)溫度是37℃且震蕩速度是120rpm。經(jīng)過2天的培養(yǎng)，菌絲體被均質(zhì)，并在900ml的無菌培養(yǎng)物中接種100ml均質(zhì)的種子培養(yǎng)物。生產(chǎn)培養(yǎng)的體積是1升；其培養(yǎng)溫度是37℃，以及震蕩速度是160rpm。培養(yǎng)繼續(xù)14天。平行進(jìn)行四種培養(yǎng)。酶活性分析M.albomyces培養(yǎng)溶液的漆酶活性通過采用ABTS測(cè)定。漆酶氧化ABTS為暗綠色陽離子基團(tuán)?；钚苑治龈鶕?jù)Niku-Paavola等(1988)開發(fā)的方法進(jìn)行。將樣品用pH4.5、0.025M琥珀酸鹽緩沖液稀釋。0.350ml的ABTS溶液(11g/l)被加進(jìn)1.15ml的稀釋液中，且此反應(yīng)通過PerkinElmerλ20分光光度計(jì)在波長(zhǎng)436nm下跟蹤測(cè)定2分鐘。M.albomyces培養(yǎng)物的測(cè)定的漆酶活性在圖1中顯示。提純將其中通過過濾細(xì)胞被除去的培養(yǎng)液通過Amicon8400過濾裝置采用PM30的膜(Millipore)超濾。在過濾中，溶液被濃縮并且加入蒸餾水，以便有可能通過離子交換層析將溶液的導(dǎo)電性降至要求的水平。其導(dǎo)電性通過應(yīng)用EDV導(dǎo)電性儀器(鉑電極MettlerToledo)被測(cè)定。超濾后，溶液通過陰離子交換層析(DEAESepharoseFastFlow，h＝10cm，V＝20ml，Pharmacia)被提純。該樹脂在室溫下用pH5、0.01M乙酸鹽緩沖液平衡。通過應(yīng)用0-0.5M硫酸鈉(Merck)的遞增的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。梯度總體積為90ml以及流速為2ml/分鐘。在梯度洗脫過程中，收集4ml餾分。測(cè)定蛋白含量、漆酶活性和餾分的導(dǎo)電性。餾分的漆酶活性和蛋白含量在圖2中顯示。陰離子交換的最佳漆酶餾分被合并，它們進(jìn)一步通過疏水作用層析(HIC)被提純(PhenylSepharoseFastFlow，h＝9cm，V＝18ml，Pharmacia)。蛋白的疏水性在層析前通過樣品中加入硫酸鈉而增加，以便鹽含量成為0.7M。樹脂用含有1M硫酸鈉的pH5、0.02M檸檬酸鹽緩沖液室溫下平衡。樣品用遞減的線性鹽梯度通過應(yīng)用含有0.7-0M硫酸鈉的檸檬酸緩沖液從柱中洗脫。梯度的總體積為90ml以及流速為2ml/分鐘。經(jīng)梯度洗脫后，樹脂以平衡緩沖液沖洗，并最終用水沖洗。在梯度洗脫和隨后的用緩沖液和水的沖洗滌過程中，收集3.5ml餾分，測(cè)定其中的漆酶活性、蛋白含量和鹽含量(圖3)。大多數(shù)離子交換和HIC的目的餾分被分析，根據(jù)Laemmli(1970)的方法，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)監(jiān)測(cè)漆酶的純度。在凝膠電泳中，使用Bio-Rad設(shè)備(Bio-RadReadyGelCell)以及現(xiàn)成的聚丙烯酰胺凝膠(12％Tris-HClReadyGel)。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R350染色溶液(Pharmacia)染色。PrestainedProteinMarkerBroadRange#77708S(NewEnglandBioLabs)作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用。按SDS-PAGE測(cè)定，M.albomyces漆酶的分子量是80kDa。M.albomyces漆酶的特征鑒定活性的溫度依賴性提純的M.albomyces漆酶活性對(duì)溫度的依賴性通過在溫度25、40、50、60、70、80和90℃下用ABTS測(cè)量漆酶活性來解釋。酶被稀釋到經(jīng)調(diào)節(jié)的pH4.5、0.025M琥珀酸緩沖液中。加酶后立即加入被調(diào)節(jié)的ABTS溶液。樣品在所需溫度下孵育2分鐘，此后在436nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。為了使添加的酶溶液不相當(dāng)大地降低緩沖液的溫度，在所有稀釋液中加入緩沖液的酶體積低于總體積的7％。M.albomyces漆酶活性對(duì)溫度的依賴性在圖4中顯示。最適pH提純的M.albomyces漆酶的最適pH的確定是通過采用愈創(chuàng)木酚方法，在pH值分別為3、4、5、6、7和8的McIlvaine緩沖液中測(cè)量漆酶活性。由于當(dāng)pH超過7時(shí)ABTS不起作用，因此選擇愈創(chuàng)木酚。酶被稀釋到緩沖液，并且加入酶后立即加入25μl的1％愈創(chuàng)木酚溶液。通過分光光度計(jì)在波長(zhǎng)465nm下此反應(yīng)被追蹤達(dá)5分鐘。M.albomyces漆酶活性對(duì)pH值的依賴性在圖5中顯示。熱穩(wěn)定性M.albomyces漆酶的熱穩(wěn)定性的確定是50、60、70和80℃下將該酶孵育在pH6、0.06M檸檬酸緩沖液中。在各溫度下酶殘留活性在孵育15、30、60和120分鐘后通過ABTS方法被解釋。熱穩(wěn)定性的測(cè)量結(jié)果在圖6中顯示。提純的M.albomyces漆酶的熱穩(wěn)定性在上述條件下被確定。其結(jié)果在圖7中顯示。該結(jié)果說明酶殘留活性在60℃基本保持不變長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)。經(jīng)4小時(shí)孵育后，仍然保留有60％的殘留活性，而6小時(shí)后則保留40％。pH穩(wěn)定性M.albomyces漆酶的pH穩(wěn)定性的確定是在室溫下和pH值為2、3、4、5、6、7和8的Mcllvaine緩沖液中孵育此酶。各pH下被孵育樣品中酶的殘留活性在孵育1、3、5和22小時(shí)后通過ABTS方法被解釋。pH穩(wěn)定性測(cè)量的結(jié)果在圖8中顯示。等電點(diǎn)M.albomyces漆酶的等電點(diǎn)通過等電聚焦而確定。0.5mm厚度的聚丙烯酰胺凝膠含有7.5％丙烯酰胺(Merck)、0.225％N，N′-雙-亞甲基丙烯酰胺(Merck)、6％兩性電解質(zhì)(針對(duì)IEF的Pharmalyte2.5-5，Pharmacia)、0.05％過硫酸銨(Merck)和0.05％N，N，N，N′-四亞甲基二胺(Merck)。等電聚焦采用MultiphorII電泳設(shè)備(PharmaciaLKB)。凝膠用活性染料染色，其中凝膠在稀釋的ABTS溶液(1g/l)中浸泡約10秒鐘。大約15分鐘后，此漆酶帶出現(xiàn)綠色。凝膠的pH分布通過應(yīng)用pH表面電極(MettlerToledo)被確定。根據(jù)等電聚焦，M.albomyces漆酶的等電點(diǎn)是4.0。漆酶能用于從織物染色中脫色。漆酶氧化很多染料，這能以脫色而被觀察?？椢锶旧拿撋ㄟ^應(yīng)用通常用于織物工業(yè)的染料黑鉆PLC被測(cè)量。漆酶處理在pH7.5和溫度40℃和60℃下實(shí)施2小時(shí)，漆酶的劑量是20nkat/mg染料。以最大吸光度(560nm)為基礎(chǔ)，Melanocarpus漆酶在40℃除去34％的顏色以及在60℃則去除16％，而Trametes漆酶在40℃僅去除14％并在60℃僅去除為1％(圖1)。M.albomyces漆酶脫色的能力在pH5和8與T.hirsuta漆酶相比較。脫色能力采用常規(guī)用于織物工業(yè)的染料來研究。顏色溶液(50mg/l)以1nkat/ml50mM琥珀酸鹽緩沖液(pH5)或磷酸鹽緩沖液(pH8)，在40℃溫度下漆酶劑量被氧化24小時(shí)。肉眼觀察跟蹤脫色。其結(jié)果在表1中顯示。如結(jié)果所示，兩種酶均氧化被測(cè)試的染料以致于它們?cè)趐H5下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色。T.hirsuta漆酶在pH8是無效的，其不氧化被測(cè)試的染料，與M.albomyces漆酶不同，其即便在pH8也能氧化染料。該結(jié)果顯示M.albomyces漆酶在染料氧化中的表現(xiàn)較傳統(tǒng)的Trametes漆酶要廣泛得多。表1.在pH5和8下用T.hirsuta和M.albomyces漆酶對(duì)織物染色的去除。(+＝顏色從溶液中去除，-＝無顏色從溶液中去除)實(shí)施例5M.albomyces漆酶在聚合中的用途測(cè)試以嗜熱的漆酶研究了標(biāo)準(zhǔn)化合物(木質(zhì)素，Westvaco或者IndulinAT，Sigma)的聚合作用。木質(zhì)素是典型的漆酶芳香族底物。參考測(cè)試是用分離自Trameteshirsuta的漆酶來實(shí)施。測(cè)試條件如下底物濃度1％、pH7.5，以及溫度40℃或者60℃。漆酶含量為200nkat/g。在測(cè)試過程中將反應(yīng)混合物通入空氣。聚合作用通過采用GPC(凝膠滲透層析)確定聚合的木質(zhì)素分子量的增加而追蹤。在反應(yīng)結(jié)束(30分鐘)時(shí)，發(fā)現(xiàn)嗜熱M.albomyces漆酶在高溫和高pH下較參考漆酶作用更加有效。圖12舉例說明一種情況，其中木質(zhì)素的聚合在40℃下實(shí)施，以及相應(yīng)地在60℃下實(shí)施顯示于圖13中。Melanocarpus漆酶導(dǎo)致分子大小的平均增加和小分子部分的降低，明顯好于Trametes漆酶。圖14顯示Melanocarpus漆酶和Trametes漆酶于70℃下在源于木質(zhì)素和提取物的化合物的聚合作用中如何表現(xiàn)。圖14中，Melanocarpus漆酶顯然地降低了小分子的含量。表2.由用M.albomyces漆酶和T.hirsuta漆酶處理的纖維構(gòu)成的層的密度和光散射實(shí)施例8M.albomyces漆酶在纖維脫木質(zhì)化作用中的用途介質(zhì)能用于擴(kuò)大漆酶的底物范圍，其中，在聚合物的脫木質(zhì)化作用或者其它間接的氧化作用。羥基苯并三唑?yàn)楸惶暨x介質(zhì)。嗜熱的漆酶在介質(zhì)介導(dǎo)的氧化中被用于分解牛皮紙纖維的木質(zhì)素。其反應(yīng)條件如下牛皮紙漿、卡帕數(shù)約為29、密度4％、介質(zhì)含量為紙漿的1％、pH調(diào)節(jié)至7、以及溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)、漆酶含量為500nkat/g，氧壓0.5mPa。Trametes漆酶充當(dāng)參考物質(zhì)。處理后，將紙漿進(jìn)行堿性提取、螯合作用和一步過氧化物漂白。堿性提取后木質(zhì)素的分解通過在波長(zhǎng)280nm下測(cè)量濾液的吸光度而被監(jiān)測(cè)。手工層由紙漿和ISO亮度制備，并且測(cè)量卡帕數(shù)。如結(jié)果顯示(表3)，M.albomyces漆酶在此測(cè)試條件下較參考漆酶作用更加有效；較參照漆酶它更加降低了層的卡帕值(木質(zhì)素含量)并更加增加了濾液的吸光度280nm。表3.LM處理對(duì)具有LQ-E-P序列的牛皮紙漿(К29)的漂白率的影響實(shí)施例9M.albomyces漆酶基因和其cDNA的分離根據(jù)Raeder和Broda(1985)的方法，從細(xì)胞中分離總DNA?；蚪M文庫的構(gòu)建采用商業(yè)反應(yīng)成套試劑(SuperCosICosmidVectorKit，Stratagene)，按照制造商的說明書進(jìn)行。100μgDNA用5單位的Sau3AI限制酶(NewEnglandBiolabs)通過在37℃孵育10分鐘被部分切割。消化的DNA以20單位的CIAP(小牛腸堿性磷酸酶，F(xiàn)innzymes)被脫磷酸化。不同長(zhǎng)度的DNA分子的分離以15-30％蔗糖梯度在20℃下超速離心22小時(shí)以及轉(zhuǎn)速為22000rpm(BeckmanSW41TI轉(zhuǎn)子)而進(jìn)行。12ml蔗糖梯度被分成300μl餾分，并且將每隔一個(gè)餾分的10μl通過電泳在0.5％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)。根據(jù)凝膠電泳，將含有長(zhǎng)度多于20千堿基對(duì)的DNA片段的餾分合并，并從中用乙醇沉淀DNA。將獲得的DNA(約2μg)插入到SuperCosI粘粒載體(約1μg)中，該載體已用XbaI(NewEnglandBiolabs)消化，然后用CIAP脫磷酸化，最終用BamHI(BoehringerMannheim)所消化。連接采用T4DNA連接酶(Promega)在4℃下孵育混合物過夜來完成。將連接混合物通過應(yīng)用商業(yè)反應(yīng)成套試劑(GigapackIIIGold包裝提取物，Stratagene)根據(jù)制造商的說明書，裝配到λ顆粒中，并將裝配的噬菌體用于感染大腸桿菌宿主細(xì)胞(XL1-BlueMR菌株，Stratagene)。一次連接提供多于5×106克隆，它可被認(rèn)為是代表性的基因庫。用于基因庫篩選的雜交探針從Podosporaanserina真菌的lac2基因中獲得。此基因被選為探針，這是因?yàn)镸.albomyces漆酶的N-末端氨基酸序列和內(nèi)肽同源于Podosporaanserina漆酶的氨基酸序列。使Podosporaanserina真菌生長(zhǎng)在底物中，其在圖1中描述。根據(jù)制造商的說明書采用商業(yè)反應(yīng)成套試劑(EasyDNAKit，Invitrogen)，將基因組DNA分離自菌絲體，它在生長(zhǎng)三天后被收集并凍干。lac2基因通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增，使用基于lac2基因公布的序列的引物5′-TGCCACACTGCCGCCAACCGTGCT-3′(SEQIDNO3)(正向)和5′-GTTCTTGATATACCAATCAGGATG-3′(SEQIDNO4)(反向)。用于擴(kuò)增的PCR程序包含26個(gè)循環(huán)，其中溫度程序如下在94℃DNA變性45秒，在55℃引物插入1分鐘，在72℃以聚合酶延伸DNA鏈2.5分鐘。最終，在72℃鏈被延伸5分鐘。長(zhǎng)度約1.9千堿基對(duì)的片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化獲得。它作為探針的特性通過與用M.albomyces真菌的基因組DNASouthern雜交純化獲得而被檢查如下在兩個(gè)不同的反應(yīng)中，40μg的DNA用80單位的EcoRI和HindIII限制酶(NewEnglandBiolabs)，在37℃下切割5小時(shí)。片段通過在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳來分離；將DNA變性并轉(zhuǎn)移至HybondN膜上(AmershamPharmaciaBiotech)(此方法在Sambrook等，1989中描述)。P.anserina的lac2基因通過應(yīng)用商業(yè)反應(yīng)成套試劑(隨機(jī)引發(fā)的DNA標(biāo)記試劑盒，BoehringerMannheim)并根據(jù)制造商的說明書用α-32p-dCTP標(biāo)記，以及探針的結(jié)合在四種不同的雜交溫度48、50、55和60℃下被檢測(cè)。雜交溶液含有6×SSC、1×Denhardt試劑(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml的鯡精子DNA(SSC含有0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)。雜交包含約5×105cpm/ml的標(biāo)記探針。雜交后，把膜在含有0.1％SDS的2×SSC中室溫下洗滌兩次，每次5分鐘，此后，在相同溫度下進(jìn)行雜交30分鐘。膜用薄膜密封在曝光的暗盒內(nèi)，并且曝光的薄膜顯示P.anserinalac2基因與DNA片段雜交，其長(zhǎng)度約4.5千堿基對(duì)并用EcoRI酶切割。來自獲得的基因組基因庫的約5×105克隆被置于瓊脂板上，并將已生長(zhǎng)過夜的克隆被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Protran，Schleicher和Schuell)上。將由克隆所得到的DNA變性(Sambrook等，1989)并通過在80℃加熱2小時(shí)被附著到膜上。DNA附著后，細(xì)菌克隆的剩余通過在48℃用洗液(Sambrook等，1989)清洗，它們可從膜上洗去。將與膜結(jié)合的DNA在57℃下與用α-32p-dCTP(雜交溶液，如上)標(biāo)記的P.anserinalac2基因雜交過夜。根據(jù)獲得的雜交信號(hào)，若干個(gè)克隆從原始平板中挑選出來，這些克隆已與P.anserinalac2基因雜交。把這些克隆與P.anserinalac2基因進(jìn)一步雜交，并根據(jù)放射性信號(hào)，6個(gè)克隆被挑選為進(jìn)一步檢查。粘粒(質(zhì)粒提純方案，Tip-500，QIAGEN)從它們中分離。使從粘粒中分離漆酶基因成為可能的限制酶通過以19種不同的限制酶切割此粘粒而被尋找。獲得的片段在57℃下應(yīng)用P.anserinalac2基因如上所述進(jìn)行Southern雜交。長(zhǎng)度約為4.5千堿基對(duì)的EcolRI片段被再次與lac2基因雜交。粘粒用EcolRI切割，以及片段通過瓊脂糖凝膠電泳提純。將獲得的片段插入到質(zhì)粒pBluescriptSK-(Stratagene)中，并將質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌宿主細(xì)胞(菌株DH5α，GibcoBRL)中。克隆從轉(zhuǎn)化中獲得，在pLLK1質(zhì)粒中含有所需的EcolRI片段。應(yīng)用合成的寡核苷酸引物，漆酶基因從該質(zhì)粒被測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)根據(jù)制造商的說明書應(yīng)用商業(yè)反應(yīng)成套試劑(DNA測(cè)序試劑盒，若丹明終止子循環(huán)測(cè)序現(xiàn)成反應(yīng)，PEBiosystems)來實(shí)施。為了建立M.albomyces漆酶基因含有的內(nèi)含子，根據(jù)制造商的說明書應(yīng)用一種商業(yè)反應(yīng)成套試劑(FirstChoiceTMRLM-RACE試劑盒，Ambion，Inc.)，將對(duì)應(yīng)于M.albomyces漆酶的互補(bǔ)DNA(cDNA)通過RACE-PCR克隆。根據(jù)制造商的說明書通過應(yīng)用一種商業(yè)反應(yīng)成套試劑(TRIZOL試劑，LifeTechnologies)，將RNA從M.albomyces細(xì)胞中分離。將RNA脫磷酸化并且通過使用反轉(zhuǎn)錄酶翻譯成DNA，隨后根據(jù)制造商的說明書通過單獨(dú)的PCR反應(yīng)，將基因的5′和3′末端擴(kuò)增。cDNA兩末端的擴(kuò)增應(yīng)用不同引物通過兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)來實(shí)施。在第一反應(yīng)中，將漆酶cDNA的所需部分應(yīng)用基因特異的引物擴(kuò)增，以及通過應(yīng)用另一基因特異的引物第二反應(yīng)確保了漆酶cDNA的擴(kuò)增。在各PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增所需的引物之一來自RLM-RACE試劑盒反應(yīng)成套試劑，并且它結(jié)合與cDNA末端相連的接頭區(qū)域。用于擴(kuò)增的PCR程序包含35個(gè)循環(huán)，其中溫度程序如下在94℃DNA變性30秒，在60-62℃引物插入30秒，在72℃DNA鏈的延伸2分鐘。在5′末端的擴(kuò)增中，引物插入的溫度是60℃，而在3′末端的擴(kuò)增中則為62℃。最終，鏈的延伸在72℃進(jìn)行7分鐘。用于5′末端擴(kuò)增的基因特異的引物如下在第一個(gè)PCR反應(yīng)中，5-GCCGGTGAGGATGTAGTCGATGAT-3′(SEQIDNO5)，和在第二個(gè)反應(yīng)中，5′-AGGTGACGTTGAACCAGTAGTTGTC-3′(SEQIDNO6)。用于3′末端擴(kuò)增的基因特異的引物如下在第一個(gè)PCR反應(yīng)中，5′-CTGGTGCACTTCACGCAGAACAA-3′(SEQIDNO7)，和在第二個(gè)反應(yīng)中，5′-AGAACCACTTCCAGGTGTCGCT-3′(SEQIDNO8)。從RLM-RACE反應(yīng)中，長(zhǎng)度為1194堿基對(duì)的片段從5′末端獲得，并且長(zhǎng)度為1322堿基對(duì)的片段從3′末端獲得。片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并根據(jù)制造商的說明書通過應(yīng)用一種商業(yè)反應(yīng)成套試劑(TOPOTA克隆試劑盒，Invitrogen)克隆到pCR2.1-TOPOTM載體上。將質(zhì)粒根據(jù)反應(yīng)成套試劑說明書通過電穿孔方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞(菌株TOP10F′，Invitrogen)中。把克隆的片段測(cè)序，并通過比較基因組序列與所得到的cDNA序列而建立M.albomyces漆酶基因中內(nèi)含子的位置。基因的基因組序列在圖15中顯示。內(nèi)含子被下畫線。參考文獻(xiàn)Altschuletal.1990.J.Mol.Biol.215,403-410.(分子生物學(xué)雜志)Berkaetal.1997.AppliedandEnvironmentalMicrobiology63(8)3151-3157.(應(yīng)用與環(huán)境微生物)Bharathi，M.S.andRamalingam，K.1993.J.Anim.Morphol.Physiol.40(1&2)153.(動(dòng)物形態(tài)生理學(xué)雜志)Diamantidisetal.2000.SoilBiology&Biochemistry32919-927.(土壤生物及生物化學(xué))Fernandez-Larrea&Stahl.1996.Mol.Gen.Genet.252,539-551.(分子及普通遺傳學(xué))Heinzkilletal.1998.Appl.Environ.Microbiol.641601-1606.(應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué))Jnssonetal.1997.Curr.Genet.32425-430.(現(xiàn)代遺傳學(xué))Laemmli1970.Nature27680-685.(自然)Lowryetal.1951.J.Biol.Chem.193265-275.(生物化學(xué)雜志)Kojimaetal.1990.J.Biol.Chem.26515224-15230.(生物化學(xué)雜志)Niku-Paavolaetal.1988.Biochem.J.254877-884.(生物化學(xué)雜志)Paszczynskietal.1985.FEMSMicrobiol.Lett.29(1985)37-41.Ravanko，K.1996.(FEMS微生物通訊)Termostabiilinlakkaasinseulonta(ScreeningofThermostableLaccase).Master′sThesis.97p.4Appendices.(InFinnish)((熱穩(wěn)定漆酶的篩選)碩士論文)RaederandBroda，1985.Lett.Appl.microbiol.117-20.(應(yīng)用微生物通訊)Saloheimoetal.1985.J.Gen.Microbiol.1371537-1544.(普通微生物雜志)SaloheimoandNiku-Paavola.1991.Bio/Technology9987-990.(生物/技術(shù))Sambrooketal.，1989，Molecularcloningalaboratorymanual，2nd.edn.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork.(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港出版社)Yaveretal.1996.，Appl.Environ.Microbiol.62834-841.(應(yīng)用環(huán)境微生物)序列表新漆酶和編碼該酶的基因<120>(Novellaccaseandthegeneencodingtheenzyme)<130>SCT022555-09<140><141><150>20001240<151>2000-05-23<160>8<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>3116<212>DNA<213>Melanocarpusalbomyces<400>1gaattcaggatggcatcgagtgaagggcgaggaggatgtgccgaatacgagctcgtcgac60ggcttcctgctccgtcctgcgctctcctgggatcgagcggcatggggatttcttctatat120aaggggctcgacagtcgcgatcatgagattgatttttccaccctcaccaggcacaagcca180gccatcagaacctctcttccaccttcatcaggcactctccttccgtctgtcgagctcttt240cccacatttctagcaggcggtttcgacaccagccgtcttcacaccatgaagaccttcacc300agcgccctggcgctcgtggtgggcatgcttgccccgggtgccgtcgttgccgcgcctccc360agcactccggcccagcgagatctggtcgagctgcgcgaggcgaggcaggagggcggcaag420gacctccgtccccgtgagccgacgtgcaacacgccgagcaaccgggcgtgctggagcgac480ggcttcgacatcaacaccgactacgaagtcagcacgccggataccggcgtcactcagtct540gtgagtcctcctctccgcccccttggtttcgggaaggctgtccgaagggaaggaaagtcc600gaggctaactgcagacagtacgtattcaacctcactgaggttgacaactggatgggccca660gacggcgtcgtcaaggagaaggtgatgttgatcaatggtgagtcgaccgcgaatgggatg720tcgagttgccatccaaaatagacctgtgtaactgactggttcgatcacagggaacattat780gggtacgtcttatctggctgtcccggcacgccaatggcctttcttttccttgagcgtagg840acgtgcgacggactgactgagaacaataggccccaacatcgtcgcgaactggggtgatac900ggtcgaggtcaccgtgatcaacaaccttgtgaccaacggaacgtcgatccactggcacgg960catccaccagaaggacaccaacctgcacgacggcgccaacggcgtgaccgagtgtccgat1020cccgcccaagggcggccagcggacgtaccgctggcgggcgcggcagtatggcaccagctg1080gtaccactcgcacttctcggcgcagtacggcaacggcgtggtgggcacgatccagatcaa1140cggcccggcgtcgctgccctacgacatcgaccttggcgtgttccccatcaccgactacta1200ctaccgggccgccgacgacctggtgcacttcacgcagaacaacgcgccgcccttcagcga1260caacgtgctcatcaacggcacggccgtcaacccgaacacgggcgagggccagtacgccaa1320cgtgacgctgacgccgggcaagcggcaccgcctgcgcatcctcaacacgtcgaccgagaa1380ccacttccaggtgtcgctcgtcaaccacaccatgacggtcatcgccgccgacatggtgcc1440cgtcaacgccatgacggtcgacagcctgttcctggccgtcggccagcgctacgacgtcgt1500catcgacgcctcgagagccccggacaactactggttcaacgtcacctttggcggccaggc1560ggcgtgcggcggctcgctcaacccgcacccggccgccatcttccactacgccggcgcgcc1620cggcggcctgcccaccgacgagggcacgcccccggtcgaccaccagtgcctggacacgct1680cgacgtgcgccccgtcgtgccgcgcagcgtgcccgtcaacagcttcgtcaagcggcccga1740caacacgctgccggtggcgctcgacctgaccggcacgcccctgttcgtgtggaaggtcaa1800cggcagcgacatcaacgtcgactggggcaagcccatcatcgactacatcctcaccggcaa1860caccagctaccccgtgtcggacaacatcgtgcaggttgatgccgtcgatcaggtatgtcc1920tctgttaaagccttacgtcgtacgattgcgctggcaaatcacacctcgtactgacgccaa1980accaccacctcccttctagtggacatactggctcatcgagaacgatccggagggcccctt2040cagcctgccgcacccgatgcacctccacgtaagtggccaaccctgtcacgtacgttgcaa2100ccgccctctcccgggccccccaactcacacttcggactcccgtcccacagggccacgact2160tcctcgtgctggggcggtcgcccgacgtgccggcggcgtcgcagcagcgcttcgtgttcg2220acccggccgtggacctggcgcggctcaacggcgacaacccgccgcggcgcgacaccacga2280tgctgccggccggcggctggctgctgctcgccttccgcaccgacaacccgggcgcctggc2340tcttccactgccacatcgcctggcacgtgtcgggcggcctgtcggtcgacttcctcgagc2400gccccgccgacctgcgccagcgcatctcccaggaggacgaggacgacttcaaccgcgtct2460gcgacgagtggcgcgcctactggccgacgaatccctaccccaagatcgactcgggcctga2520agcgtcgccgctgggtggaggagagcgagtggctggttcgttgatgggggaaaggggggg2580taggtgcgattcaggggtacctagggtgcacttgatgttgatgctcgatggagaattggt2640tttggttacttgttgttcactttcgacatgcgttggtccttgtttggattttttaggttg2700tccagatgatggatgatatggtaccgagggaactgtggtcttgccttcgaaaggggactt2760catgttatggtaccacaggaccagttatcgaagcatccttgttttcaatcgcatcttttt2820tcccccgatgcctcgagtacatgatgcccatagtgagtcgtagcacaccagccacaccac2880ctacctcccttcccgcaacgccatcatgcggtacgccaaatcaaggtcctccacaatccc2940atgccaatcgccgcacctccgcacagcaacctcgatcctcctccggaacgcctcgccagc3000atcaatcgcccgcccaaccccccgtacatcaccaccaggcgaaggctccgtctcgtccac3060cccaaccacccgccagtaccgcagcagcccgacgtcctctcgaccggcgcaagcac3116<210>2<211>623<212>PRT<213>Melanocarpusalbomyces<400>2MetLysThrPheThrSerAlaLeuAlaLeuValValGlyMetLeuAla151015ProGlyAlaValValAlaAlaProProSerThrProAlaGlnArgAsp202530LeuValGluLeuArgGluAlaArgGlnGluGlyGlyLysAspLeuArg354045ProArgGluProThrCysAsnThrProSerAsnArgAlaCysTrpSer505560AspGlyPheAspIleAsnThrAspTyrGluValSerThrProAspThr65707580GlyValThrGlnSerTyrValPheAsnLeuThrGluValAspAsnTrp859095MetGlyProAspGlyValValLysGluLysValMetLeuIleAsnGly100105110AsnIleMetGlyProAsnIleValAlaAsnTrpGlyAspThrValGlu115120125ValThrValIleAsnAsnLeuValThrAsnGlyThrSerIleHisTrp130135140HisGlyIleHisGlnLysAspThrAsnLeuHisAspGlyAlaAsnGly145150155160ValThrGluCysProIleProProLysGlyGlyGlnArgThrTyrArg165170175TrpArgAlaArgGlnTyrGlyThrSerTrpTyrHisSerHisPheSer180185190AlaGlnTyrGlyAsnGlyValValGlyThrIleGlnIleAsnGlyPro195200205AlaSerLeuProTyrAspIleAspLeuGlyValPheProIleThrAsp210215220TyrTyrTyrArgAlaAlaAspAspLeuValHisPheThrGlnAsnAsn225230235240AlaProProPheSerAspAsnValLeuIleAsnGlyThrAlaValAsn245250255ProAsnThrGlyGluGlyGlnTyrAlaAsnValThrLeuThrProGly260265270LysArgHisArgLeuArgIleLeuAsnThrSerThrGluAsnHisPhe275280285GlnValSerLeuValAsnHisThrMetThrValIleAlaAlaAspMet290295300ValProValAsnAlaMetThrValAspSerLeuPheLeuAlaValGly305310315320GlnArgTyrAspValValIleAspAlaSerArgAlaProAspAsnTyr325330335TrpPheAsnValThrPheGlyGlyGlnAlaAlaCysGlyGlySerLeu340345350AsnProHisProAlaAlaIlePheHisTyrAlaGlyAlaProGlyGly355360365LeuProThrAspGluGlyThrProProValAspHisGlnCysLeuAsp370375380ThrLeuAspValArgProValValProArgSerValProValAsnSer385390395400PheValLysArgProAspAsnThrLeuProValAlaLeuAspLeuThr405410415GlyThrProLeuPheValTrpLysValAsnGlySerAspIleAsnVal420425430AspTrpGlyLysProIleIleAspTyrIleLeuThrGlyAsnThrSer435440445TyrProValSerAspAsnIleValGlnValAspAlaValAspGlnTrp450455460ThrTyrTrpLeuIleGluAsnAspProGluGlyProPheSerLeuPro465470475480HisProMetHisLeuHisGlyHisAspPheLeuValLeuGlyArgSer485490495ProAspValProAlaAlaSerGlnGlnArgPheValPheAspProAla500505510ValAspLeuAlaArgLeuAsnGlyAspAsnProProArgArgAspThr515520525ThrMetLeuProAlaGlyGlyTrpLeuLeuLeuAlaPheArgThrAsp53053S540AsnProGlyAlaTrpLeupheHisCysHisIleAlaTrpHisValSer545550555560GlyGlyLeuSerValAspPheLeuGluArgProAlaAspLeuArgGln565570575ArgIleSerGlnGluAspGluAspAspPheAsnArgValCysAspGlu580585590TrpArgAlaTyrTrpProThrAsnProTyrProLysIleAspSerGly595600605LeuLysArgArgArgTrpValGluGluSerGluTrpLeuValArg610615620<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3tgccacactgccgccaaccgtgct24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4gttcttgatataccaatcaggatg24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5gccggtgaggatgtagtcgatgat24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>6aggtgacgttgaaccagtagttgtc25<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>7ctggtgcacttcacgcagaacaa23<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>8agaaccacttccaggtgtcgct2權(quán)利要求1.一種漆酶，其特征在于它可從Melanocarpus屬的菌株中分離，并且該酶的最適pH為5-8以及該酶在pH3-9和溫度30-80℃起作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漆酶，其特征在于它可從M.albomyces菌株中分離。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的漆酶，其特征在于該酶的最適pH為6-8。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的漆酶，其特征在于該酶在溫度50-80℃下作用最佳。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的漆酶，其特征在于該酶的最適pH約是7.5，最適溫度約為70℃。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的漆酶，其特征在于該酶的活性在60℃下2小時(shí)基本保持不變。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的漆酶，其特征在于純化的酶按等電聚焦所確定的等電點(diǎn)約是4.0，并且其分子量按SDS-PAGE所確定的約為80kDa。8.一種分離且純化的Melanocarpus漆酶，優(yōu)選是一種Melanocarpusalbomyces漆酶。9.一種包含Melanocarpus漆酶的酶制劑，優(yōu)選以Melanocarpusalbomyces漆酶作為主要活性。10.一種酶制劑，其特征在于它包含比Melanocarpus屬的菌株天然產(chǎn)生到其培養(yǎng)液中的更多的根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的漆酶。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制劑，其特征在于該酶的最適pH為5-8并且該酶在pH3-9和溫度30-80℃起作用。12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于該酶按等電聚焦所確定的等電點(diǎn)約是4.0，并且其分子量按SDS-PAGE所確定的約為80kDa。13.編碼具有漆酶活性的多肽的核酸分子，其特征在于該核酸分子選自a)一種核酸分子，其包含如SEQIDNO1或者圖15中所描述的核苷酸序列的編碼區(qū)；b)一種核酸分子，其編碼包含如SEQIDNO2或者圖中15所描述氨基酸序列的多肽；c)一種核酸分子，其包含編碼序列，所述編碼序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性區(qū)別于SEQIDNO1或者圖15的編碼序列；d)一種核酸分子，其與SEQIDNO1或者圖15的核苷酸序列雜交；e)一種核酸分子，其編碼多肽，所述多肽具有漆酶活性且它的氨基酸序列與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列比較顯示至少73％的同一性。14.編碼具有漆酶活性的多肽的核酸分子，其特征在于該多肽的氨基酸序列與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列比較顯示至少80％的同一性。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的核酸分子，其特征在于它是編碼包含如SEQIDNO2或者圖15中所描述的氨基酸序列的多肽的核酸分子。16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)所述的核酸分子，其特征在于它是包含如SEQIDNO1或者圖15中所描述的核苷酸序列的編碼區(qū)的核酸分子。17.根據(jù)權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)所述的核酸分子，其特征在于它編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的酶。18.一種載體，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)所述的核酸分子。19.一種微生物宿主，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求18所述的載體已被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到其中。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主，其特征在于它是絲狀真菌、酵母菌或細(xì)菌。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的宿主，其特征在于它屬于曲霉屬、木霉屬或鐮孢霉屬。22.生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于-將根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求18所述的載體轉(zhuǎn)移到微生物宿主細(xì)胞中用于表達(dá)核酸分子，以及任選地用于從宿主細(xì)胞中分泌所表達(dá)的多肽；以及-從細(xì)胞或從微生物宿主的培養(yǎng)液中回收具有漆酶活性的多肽。23.一種多肽，其具有漆酶活性，其特征在于它被選自下列的核酸分子所編碼a)一種核酸分子，其包含如SEQIDNO1或者圖15所描述的核苷酸序列的編碼區(qū)；b)一種核酸分子，其編碼包含如SEQIDNO2或者圖15中所描述的氨基酸序列的多肽；c)一種核酸分子，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其區(qū)別于SEQIDNO1或者圖15的核苷酸序列的編碼序列；d)一種核酸分子，其與SEQIDNO1或者圖15的核苷酸序列雜交；以及e)一核酸分子，其編碼具有漆酶活性的多肽，并且該多肽的氨基酸序列與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列比較顯示至少73％的同一性。24.一種具有漆酶活性的多肽，其特征在于它包含氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO2或者圖15的氨基酸序列比較顯示至少80％的同一性。25.一種酶制劑，其特征在于它包含作為主要活性的根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽，所述多肽具有漆酶活性。26.一種酶制劑，其特征在于它包含比Melanocarpus屬菌株天然生產(chǎn)到其培養(yǎng)液中的更多的根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的多肽，所述多肽具有漆酶活性。27.根據(jù)權(quán)利要求9-12、25或26任一項(xiàng)所述的酶制劑，其特征在于它包含10mg/l以上，優(yōu)選≥30mg/l的漆酶。28.根據(jù)權(quán)利要求9-12、25-27任一項(xiàng)所述的酶制劑，其特征在于它包含至少一種添加劑，例如穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。29.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶在氧化染色劑中的用途。30.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶在聚合化合物中的用途。31.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶在氧化纖維中的用途。32.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶在纖維去木質(zhì)素中的用途。33.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶在改善造紙機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)性能中的用途。34.一種氧化染色劑的方法，其特征在于在存在足夠量的氧、pH4-8和溫度40-80℃下，按每克染色劑使用約1-1000nkat的漆酶，將染色劑與根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶接觸5分鐘-24小時(shí)。35.一種聚合化合物的方法，其特征在于在存在足夠量的氧、pH4-8和溫度40-80℃下，按每克待聚合的物質(zhì)使用約1-1000nkat的漆酶，將有待結(jié)合的化合物與根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶接觸5分鐘-24小時(shí)。36.一種氧化纖維的方法，其特征在于在存在足夠量的氧、pH5-8和溫度50-80℃下，按每克干物質(zhì)纖維使用約1-1000nkat的漆酶，將有待氧化的纖維與根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶接觸5分鐘-24小時(shí)。37.一種去木質(zhì)素纖維的方法，其特征在于在存在足夠量的氧、pH5-8和溫度50-80℃下，按每克干物質(zhì)纖維使用約1-1000nkat的漆酶，將有待去木質(zhì)素的纖維與根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶接觸5分鐘-24小時(shí)。38.一種改善造紙機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)性能的方法，其特征在于將根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的漆酶、根據(jù)權(quán)利要求9-12或25-28任一項(xiàng)所述的酶制劑或根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求22所述方法而獲得的漆酶以每克干物質(zhì)、纖維或每升循環(huán)水使用1-1000nkat漆酶的量加入到處理水中或加入到造紙機(jī)器的頭箱中。39.根據(jù)權(quán)利要求34-38任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于當(dāng)需要時(shí)將介質(zhì)用于所述方法中。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的漆酶，其分離有Melanocarpusgenus的菌株，特別是M.albomyces菌株。此酶的最適pH值是在5－8之間，且在30－80℃的溫度下起作用。由等電聚焦測(cè)定此酶的等電點(diǎn)大約是在4.0，由SDS－PAGE測(cè)定其分子量約為80kDa。此酶尤其適于pH和溫度條件都高的情況下的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼漆酶的基因以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)的漆酶。文檔編號(hào)C12N1/15GK1430668SQ01809914公開日2003年7月16日申請(qǐng)日期2001年5月23日優(yōu)先權(quán)日2000年5月23日發(fā)明者克里斯蒂納·克魯斯,勞拉-萊納·基斯基寧,瑪麗亞阿娜·雷特,利薩·維卡里,馬爾庫·薩洛黑莫申請(qǐng)人:芬蘭技術(shù)研究中心