專利名稱：：一種檢測土壤脫氫酶活性的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及土壤中脫氫酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中脫氫酶活性的分析方法。
背景技術(shù)：
：土壤中的脫氫酶能酶促脫氫反應(yīng)，即酶促有機物質(zhì)的脫氫作用。它起著氫的中間傳遞體的作用。因此，土壤中脫氫酶活性的強弱影響到土壤中有機物質(zhì)的降解，間接影響土壤肥力的高低。土壤中脫氫酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質(zhì)地的強烈影響，同時也受到農(nóng)田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中脫氫酶活性的檢驗有很重要的意義。為了測定脫氫酶的活性，Lenhard(1956)首次采用了四唑鹽，其方法原理，后來得到了不同程度的改進和完善。這些改進主要在于改變土壤稱量、四唑鹽的濃度和采用不同的甲月替提取劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢驗土壤中脫氫酶活性的分析方法。該方法是在借鑒前人測定方法的原理基礎(chǔ)上對一些實驗步驟(稱樣重、TTX濃度等)進行了改進，提高了實驗效率、甲月替的提取程度、使分析結(jié)果更加精確可靠，分析重現(xiàn)性更好。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種檢測土壤中脫氫酶活性的分析方法，1)稱取10-20g風(fēng)干土樣n份于離心管中，n22，向其中n-l支離心管中分別先用l-3ml重量濃度0.1-1XTTX溶液，后用水2-3ml，將混合物飽和至土壤最大持水量；向另一支離心管中加等量的蒸餾水代替TTX溶液，其它操作步驟相同；將離心管塞緊，放入27-29"C恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)20土lh;同時作試劑空白對照；2)培養(yǎng)結(jié)束后，1900-2100r/min離心2-5min，分別取出土壤上清液；3)然后，用10-20ml提取劑丙酮分別處理土壤8-10min，以提取生成的甲月替，將混合物離心1900-2100r/min離心2-6min，將上清液分別倒入容量瓶中；4)用提取劑丙酮分別向三角瓶中洗滌沉淀2-4次，至獲得無色提取液，將提取液全部轉(zhuǎn)移到其相應(yīng)的容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度計上于485nm處比色測定吸光度A;6)制作標準曲線用提取劑丙酮配制一系列TPF標準溶液與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A，；以一系列TPF溶液的濃度和其所測得的吸光度值A(chǔ)'制作標準曲線，求得斜率b;7)計算濾液中甲月替的量a=A*b(根據(jù)用甲月替的標準溶液繪制的標準曲線査知)；8)計算脫氫酶活性計算公式x=av*150.35，單位微升H+Z10g干土.20h式中a為1ml濾液中甲月替的毫克數(shù)mg/ml，根據(jù)標準曲線查知；v為提取液的體積ml;150.35是將lmg甲月替換算為氫的體積(微升)的系數(shù)。對于酸性土樣品，分析前應(yīng)調(diào)節(jié)其pH為7-8.5，可采用加入碳酸鈣的方法調(diào)解，每支離心管中分別加入0.1-0.2gCaC03充分混合，混勻向其中n-l支離心管中加入l-3ml重量濃度0.1-l^TTX溶液，另1支離心管中加入等量的蒸餾水代替TTX溶液作為樣本對照。所述制作標準曲線過程如下，吸取10mllmg/ml的TPF標準溶液用丙酮稀釋至100ml，其濃度為100(igTPF/ml，分別吸取0，5，10，15，20ml稀釋標準溶液于100ml容量瓶中，每瓶中含有TPF分別為O，0.5，1，1.5，2mg，用丙酮定容后充分搖勻，每瓶中TPF的濃度為0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml，與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A，；以一系列TPF溶液的濃度和其所測得的吸光度值A(chǔ)'制作標準曲線，求得斜率b。所述的提取劑丙酮可用甲醇或體積百分比為90%丙酮和10%四氯化碳組成的混合液替代；當(dāng)采用不同的提取劑提取培養(yǎng)土中的甲月割寸，應(yīng)采用與其相同的提取劑配制TPF標準曲線。在測定潛在的脫氫酶活性時，向反應(yīng)混合物中加入脫氫物質(zhì)葡萄糖、丙酮鹽酸或者甘露醇，其用量為l-3mg基質(zhì)/50mg土壤碳。本發(fā)明方法改進的依據(jù)土壤脫氫酶是土壤中酶促脫氫反應(yīng)的一類酶的總稱，它們都參與土壤中有機物質(zhì)的脫氫反應(yīng)?？梢杂酶鞣N碳水化合物、有機酸、氨基酸、醇類等作為脫氫基質(zhì)。在脫氫過程中離析的氫可以轉(zhuǎn)移給空氣氧或醌型有機物質(zhì)。在測定土壤的潛在脫氫酶活性時，用葡萄糖作為脫氫作用的基質(zhì)；而在測定土壤的有效脫氫酶活性時，則不加基質(zhì)。與此相同，本方法測定的是土壤的有效脫氫酶活性，以硫酸氨為底物，經(jīng)過20h的恒溫培養(yǎng)，通過計算單位時間內(nèi)單位土壤中H+的微升數(shù)來表示脫氫酶的活性。本發(fā)明所使用的測定原理為為了測定土壤中脫氫酶活性，常用無色的四唑鹽，特別是2，3,5-三苯基四唑氯化物(TTX)作為基質(zhì)，后者能接受脫氫酶活化的氫，轉(zhuǎn)變成紅色的2,3,5-三苯基甲月執(zhí)TPF)，根據(jù)顏色的深淺，用比色法485nm處測出甲月替的含量，進而計算出脫氫酶的活性。與過去的分析方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)點主要有1)所需設(shè)備簡單、降低了試驗成本。本測定方法中的培養(yǎng)試驗是在離心管中進行，不需用更加復(fù)雜的儀器，減少對設(shè)備要求的依賴性。2)所使用的方法沒有顯色過程，只是用丙酮少量多次的浸提TPF，減少操作過程的復(fù)雜性。3)操作簡單，分析結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。本發(fā)明簡化了操作步驟，易操作，方法準確度高；原來方法需要設(shè)置滅菌土壤作為對照，本發(fā)明只需要一個不加底物的溶液作為對照，與傳統(tǒng)方法比較，所需設(shè)備簡單，成本低；同時，遵循少量多次的原則，用丙酮盡可能的浸提產(chǎn)生的TPF，提高了實驗結(jié)果的準確度。具體實施方式試劑配制1CaCO，分析純21%2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTX)溶液將lgTTX溶于約80ml蒸餾水中，定容至100ml。3丙酮，分析純4三苯基甲月執(zhí)TPF)標準溶液將100mgTPF溶于約80ml丙酮中，并用丙酮定容到100ml，混勻。TPF濃度為lmg/ml。操作步驟1)稱取10g風(fēng)干土樣4份于離心管中，與0.1gCaCO3充分混合。向3支離心管中分別先用lmllXTTX溶液，后用水2ml，將混合物飽和至土壤最大持水量；向另一支離心管中加等量的蒸餾水代替TTX溶液，其它操作步驟相同。將離心管塞緊，放入28士rC恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)20h;同時作試劑空白對照；^2)培養(yǎng)結(jié)束后，2000士100r/min離心5min，取出土壤上清液；3)然后，用20ml丙酮處理土壤10min，以提取生成的甲月替，將混合物離心(2000r/min，5min)，將上清液倒入100ml容量瓶中；4)用丙酮洗滌沉淀2-4次，至獲得無色提取液，將提取液全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度計上于485nm處比色測定吸光度A;6)制作標準曲線吸取10mllmg/ml的TPF標準溶液用丙酮稀釋至100ml(濃度為100嗎TPF/ml)，分別吸取O，5，10，15，20ml稀釋標準溶液于100ml容量瓶中(每瓶中含有TPF分別為0，0.5，1，1.5，2mg)，用丙酮定容后充分搖勻(每瓶中TPF的濃度為0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml)，與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A'。以一系列TPF溶液的濃度和測得的吸光度值A(chǔ)'制作標準曲線，求得斜率b;7)計算濾液中甲月替的量a=A*b(根據(jù)用甲月替的標準溶液繪制的標準曲線査知)；8)計算脫氫酶活性計算公式x=av*150.35(單位微升lT/10g干土.20h)式中a為lml濾液中甲月替的毫克數(shù)(mg/ml根據(jù)標準曲線査6知)；v為提取液的體積(ml);150.35將lmg甲月替換算為氫的體積(微升)的系數(shù)。實施例1本實施例所使用的黑土采自于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院(公主嶺市)的長期定位試驗地，設(shè)三個不同的處理l號位對照，既不經(jīng)過任何處理和添加任何土壤添加劑在普通土壤；2號為添加有機質(zhì)處理的土壤；3號為添加有機質(zhì)和NPK處理的土壤。土壤含水量均為20%(風(fēng)干土重)，用上述方法檢測三種處理的脫氫酶活性。每種土壤得具體分析步驟如下1)稱取10g風(fēng)干土樣4份于離心管中，與0.1gCaCO3充分混合。向3支離心管中分別先用lmll^TTX溶液，后用水2ml，將混合物飽和至土壤最大持水量；向另一支離心管中加等量的蒸餾水代替TTX溶液，其它操作步驟相同。將離心管塞緊，放入28士rC恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)20h;同時作試劑空白對照；2)培養(yǎng)結(jié)束后，2000士100r/min離心5min，取出土壤上清液；3)然后，用20ml丙酮處理土壤10min，以提取生成的甲月替，將混合物離心(2000r/min，5min)，將上清液倒入100ml容量瓶中；4)用丙酮洗滌沉淀2-4次，至獲得無色提取液，將提取液全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度計上于485nm處比色測定吸光度A;6)制作標準曲線吸取10mllmg/ml的TPF標準溶液用丙酮稀釋至100ml(濃度為100嗎TPF/ml)，分別吸取0，5，10，15，20ml稀釋標準溶液于100ml容量瓶中(每瓶中含有TPF分別為0，0.5，1，1.5，2mg)，用丙酮定容后充分搖勻(每瓶中TPF的濃度為0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml)，與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A，。以一系列TPF溶液的濃度和測得的吸光度值A(chǔ)'制作標準曲線，求得斜率b;7)計算濾液中甲月替的量a=A*b(根據(jù)用甲月替的標準溶液繪制的標準曲線查知)；8)計算脫氫酶活性試驗結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.一種檢測土壤中脫氫酶活性的分析方法，其特征在于1)稱取10-20g風(fēng)干土樣n份于離心管中，n≥2，向其中n-1支離心管中分別先用1-3ml重量濃度0.1-1％TTX溶液，后用水2-3ml，將混合物飽和至土壤最大持水量；向另一支離心管中加等量的蒸餾水代替TTX溶液，其它操作步驟相同；將離心管塞緊，放入27-29℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)20土1h；同時作試劑空白對照；2)培養(yǎng)結(jié)束后，1900-2100r/min離心2-5min，分別取出土壤上清液；3)然后，用10-20ml提取劑丙酮分別處理土壤8-10min，以提取生成的甲月替，將混合物離心1900-2100r/min離心2-6min，將上清液分別倒入容量瓶中；4)用提取劑丙酮分別向三角瓶中洗滌沉淀2-4次，至獲得無色提取液，將提取液全部轉(zhuǎn)移到其相應(yīng)的容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度計上于485nm處比色測定吸光度A；6)制作標準曲線用提取劑丙酮配制一系列TPF標準溶液與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A’；以一系列TPF溶液的濃度和其所測得的吸光度值A(chǔ)’制作標準曲線，求得斜率b；7)計算濾液中甲月替的量a＝A*b；8)計算脫氫酶活性計算公式x＝av*150.35，單位微升H+/10g干土.20h式中a為1ml濾液中甲月替的毫克數(shù)mg/ml，根據(jù)標準曲線查知；v為提取液的體積ml；150.35是將1mg甲月替換算為氫的體積(微升)的系數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于對于酸性土樣品，分析前應(yīng)調(diào)節(jié)其pH為7-8.5，可采用加入碳酸鈣的方法調(diào)解，每支離心管中分別加入0.1-0.2gCaC03充分混合，混勻向其中n-l支離心管中加入l-3ml重量濃度0.1-1%TTX溶液，另1支離心管中加入等量的蒸餾水代替TTX溶液作為樣本對照。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于所述制作標準曲線過程如下，吸取10mllmg/ml的TPF標準溶液用丙酮稀釋至100ml，其濃度為100pgTPF/ml，分別吸取O，5，10，15，20ml稀釋標準溶液于100ml容量瓶中，每瓶中含有TPF分別為O，0.5，1，1.5，2mg，用丙酮定容后充分搖勻，每瓶中TPF的濃度為O，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml，與樣品一起在485nm處比色測定吸光度A，；以一系列TPF溶液的濃度和其所測得的吸光度值A(chǔ)'制作標準曲線，求得斜率b。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的提取劑丙酮可用甲醇或體積百分比為90%丙酮和10%四氯化碳組成的混合液替代；當(dāng)采用不同的提取劑提取培養(yǎng)土中的甲月替時，應(yīng)采用與其相同的提取劑配制TPF標準曲線。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于在測定潛在的脫氫酶活性時，向反應(yīng)混合物中加入脫氫物質(zhì)葡萄糖、丙酮鹽酸或者甘露醇，其用量為l-3mg基質(zhì)/50mg土壤碳。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測土壤中脫氫酶活性的分析方法1)稱取過篩的土壤風(fēng)干樣品n份于離心管中；先用TTX溶液，后用水，將混合物飽和至土壤最大持水量，將離心管塞緊，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)培養(yǎng)結(jié)束后，離心，棄除土壤上清液；3)用丙酮處理土壤，將上清液倒入容量瓶中；4)用丙酮洗滌沉淀2-4次，至獲得無色提取液，將提取液全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度計上于485nm處比色測定吸光度；6)計算提取液中的甲月替含量，進而計算脫氫酶活性。本發(fā)明優(yōu)點為1)簡化了操作步驟，易操作，方法準確度高；2)減少對設(shè)備要求的依賴性；3)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。文檔編號C12Q1/32GK101294193SQ200710011120公開日2008年10月29日申請日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者武志杰,陳利軍,雋英華申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所