C的濃度由干燥后MgAl-lactate LDH質(zhì)量和雙蒸水的含量計算得出，記為LDH-lactate-NS，全過程在他保護下進行。
[0030]步驟2:對LDH-lactate-NS進行XRD等表征分析鑒定:將剝離的LDH-lactate-NS滴在銅網(wǎng)上進行TEM成像，并烘干LDH-lactate-NS進行SEM成像。采用凝膠法將LDH-lactate-NS 置于托盤獲得 XRD 特征譜 ，并用激光照射 LDH-lactate-NS 膠體檢測丁達爾現(xiàn)象。
[0031]如圖1所示，XRD結(jié)果表明獲得了正確特征的材料(圖1A)。將合成獲得的材料進行FE-SEM成像，結(jié)果表明，剝離之前為多層垛疊結(jié)構(gòu)(圖1B)。通過水中剝離，產(chǎn)生了丁達爾現(xiàn)象，說明片層大小介于lnm?1 OOnm之間(圖1C)。HR-TEM成像表明，在水中剝離后獲得了二維結(jié)構(gòu)的LDH-lactate-NS(圖1D)。本研究中以水中剝離的二維納米片LDH-lactate-NS為載體負載生物活性分子。
[0032]步驟3，用含有不同濃度LDH-lactate-NS的培養(yǎng)基處理BY-2細胞和擬南芥，探索LDH在植物細胞中的毒理作用，建立LDH-lactate-NS對植物細胞的毒理機制模型，為后續(xù)的負載試驗提供參考:
[0033]如圖2所示。Propidium 1dide(PI)染料是一種與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光的染料。然而，PI染料無法透過活細胞完整的細胞膜。利用這一特性，用不同濃度的LDH-lactate-NS(濃度分別為25/50/100/300ug/ml)處理BY-2細胞并進行PI染色。結(jié)果顯示，當(dāng)LDH-lactate-NS的濃度為100ug/ml時，檢測到微弱的胞內(nèi)熒光。然而，LDH-lactate-NS的濃度高達300ug/ml時，檢測到極強的胞內(nèi)熒光。說明LDH-lactate-NS濃度在100ug/ml以下為負載生物活性分子的安全濃度。
[0034]如圖3所示。配制含有不同濃度LDH-lactate-NS的培養(yǎng)基(濃度分別為25/50/100/300ug/ml)，將擬南芥種子播種在該培養(yǎng)基上。種子萌發(fā)之后，統(tǒng)計幼苗(6天)的根長和胚軸長度。結(jié)果表明，LDH-lactate-NS的濃度在100ug/ml以下時，無明顯的抑制作用。而在300ug/ml時，其抑制效果為極顯著。說明LDH-lactate-NS濃度在100ug/ml以下為負載生物活性分子的安全濃度。
[0035]步驟4，將生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的質(zhì)量比進行偶聯(lián)，獲得最佳的吸附比:
[0036]將DNA 和 LDH-lactate-NS 按不同質(zhì)量比(1:1、1: 2、1: 3、1:4和 1:5)共孵育獲得 LDH-DNA偶聯(lián)物。如圖4所示，以單獨DNA作為陽性對照，以沒有DNA的電泳孔為陰性對照，對其進行灰度分析，其結(jié)果證明LDH-DNA質(zhì)量比為3:1時，即可完全吸附。
[0037]如圖5 Zeta-potential數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ITC是帶負電荷的生物活性分子，LDH-Lactate是帶正電荷的生物活性分子。將FITC和LDH-lactate-NS按不同質(zhì)量比(1:1、1: 2、1: 3、1:4和1:5)共孵育5min獲得LDH-FITC偶聯(lián)物。結(jié)果顯示LDH-lactate-NS:FITC質(zhì)量比為5:1時，電荷為0，表明其質(zhì)量比為5:1時即可完全吸附。
[0038]步驟5，通過納米片-生物活性分子復(fù)合物與植物細胞共孵育的方法，利用二維納米片載體將生物活性分子導(dǎo)入植物細胞中:
[0039]根據(jù)毒性試驗結(jié)果，將LDH-lactate-NS的濃度控制在100ug/ml以下作為工作濃度。同時，根據(jù)吸附試驗結(jié)果，以DNA:LDH-lactate-NS質(zhì)量比1:3以上，以FITC:LDH-lactate-NS質(zhì)量比1:5以上作為工作吸附比進行負載試驗。
[0040]最優(yōu)情況是:使用的FITC: LDH-lactate-NS 質(zhì)量比為1:6，DNA:LDH-lactate-NS 質(zhì)量比為1: 5，終濃度為1 Oug/ml，孵育時間為1 h。通過共聚焦熒光顯微鏡，從細胞質(zhì)中檢測到了明顯的熒光。
[0041 ] 如圖6和圖7所示，在以上的方法和試驗條件下，將LDH-Lactate-NS-FITC復(fù)合物與BY-2懸浮細胞和擬南芥共孵育后，利用confocal檢測到了強烈的胞內(nèi)熒光，說明該納米片高效負載FITC染料導(dǎo)入了BY-2細胞和擬南芥細胞中。不僅如此，LDH-Lactate-NS還能負載s sDNA-FI TC導(dǎo)入BY-2細胞(如圖8)和擬南芥細胞(如圖9)中，進一步有力地證明了我們探索獲得的方法可以高效利用LDH-Lactate-NS將生物功能分子有效導(dǎo)入完整的活體植物細胞中。
【主權(quán)項】
1.一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，其特征在于，按照以下步驟進行: 步驟1，合成乳酸根插層的類水滑石納米材料MgAl-lactate LDH，在水中剝離獲得二維納米片 LDH-lactate-NS; 步驟2，對LDH-lactate-NS進行XRD等表征分析鑒定； 步驟3，用含有不同濃度LDH-lactate-NS的緩沖液處理BY-2細胞和擬南芥，獲得其負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的安全濃度； 步驟4，將生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的質(zhì)量比進行偶聯(lián)； 步驟5，將二維納米片-生物活性分子復(fù)合物與植物細胞共孵育，把生物活性分子導(dǎo)入植物細胞中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，其特征在于，所述步驟1具體按照以下步驟進行: 將鎂/鋁摩爾比為0.5:1-6:1的鎂鋁乳酸鹽于125!^雙蒸水中在30-1001條件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中；另將大于等于鋁的摩爾量的L-乳酸溶于25mL雙蒸水中，配制成溶液B置于三頸圓底燒瓶中；在室溫下快速攪拌將溶液A逐滴滴入溶液B中，滴定過程中用氫氧化鈉溶液控制其pH體系，維持pH值為8-12;待滴定完畢后，繼續(xù)劇烈攪拌并陳化5-48h，得到乳白色混合物，用雙蒸水通過離心方法反復(fù)洗滌直至上清液變渾濁;將離心后的樣品分為兩份，一份置于真空干燥箱里室溫干燥，干燥后研磨，所得粉末為MgAl-lactate LDH;另一份置于一定量的雙蒸水中，劇烈攪拌直至沒有沉淀變?yōu)橥该鳡畹玫綉覞嵋篊，懸濁液C的濃度由干燥后MgAl-lactate LDH質(zhì)量和雙蒸水的含量計算得出，記為LDH-lactate-NS，全過程在N2保護下進行。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，其特征在于，所述步驟2具體按照以下步驟進行:將剝離的LDH-lactate-NS滴在銅網(wǎng)上進行透射電子顯微鏡成像，并烘干LDH-lactate-NS進行掃描電子顯微鏡成像，采用凝膠法將LDH-lactate-NS置于托盤獲得XRD特征譜，并用激光照射LDH-lactate-NS膠體檢測丁達爾現(xiàn)象。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，其特征在于，所述步驟4中，LDH-lactate-NS:帶負電荷的生物活性分子DNA質(zhì)量比為3:1時，LDH-lactate-NS:帶負電荷的生物活性分子FITC質(zhì)量比為5:1時，可完全吸附。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，其特征在于，所述步驟5具體按照以下步驟進行: 將LDH-lactate-NS的濃度控制在100ug/ml以下作為工作濃度，以DNA:LDH-lactate-NS質(zhì)量比1:3以上，以FITC:LDH-lactate-NS質(zhì)量比1:5以上，孵育時間為lh，即將生物活性分子導(dǎo)入植物細胞中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的方法，合成乳酸根插層的類水滑石納米材料，在水中剝離獲得二維納米片；對LDH-lactate-NS進行XRD等表征分析鑒定；用含有不同濃度LDH-lactate-NS的培養(yǎng)基處理模式植物材料BY-2細胞和擬南芥，獲得LDH-lactate-NS負載生物活性分子導(dǎo)入植物細胞的安全濃度；將生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的質(zhì)量比進行偶聯(lián)，獲得最優(yōu)吸附比的納米片-生物活性分子復(fù)合物；將最優(yōu)吸附比的納米片-生物活性分子復(fù)合物與植物細胞共孵育，以最優(yōu)孵育時間將生物活性分子導(dǎo)入完整的活體植物細胞中。
【IPC分類】C12N15/87
【公開號】CN105441484
【申請?zhí)枴緾N201510834328
【發(fā)明人】萬迎朗, 包文龍, 王強, 王君雅
【申請人】北京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年11月25日