一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重要作物病毒的人工接種方法及其應(yīng)用，尤其是一種簡單快速接 種中國小麥花葉病毒的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)是我國上世紀(jì)末在山東 發(fā)現(xiàn)的一種土傳病毒，現(xiàn)已劃入帚狀病毒科（family Virgaviridae)菌傳桿狀病毒屬 (genus Furovirus) <XWMV在小麥病株上引起典型的癥狀包括:幼葉呈現(xiàn)褪綠條紋，老葉則 黃化甚至變成紫色。嚴(yán)重的病株矮縮、萎蔫甚至死亡，從而導(dǎo)致產(chǎn)量損失嚴(yán)重。分子鑒定顯 示棒狀的CWMV粒子內(nèi)部含有2條單鏈正義RNA( ssRNA)基因組片段，分別稱為RNA1和RNA2?；?因組測序分析表明RNA1長7147nt，編碼3個(gè)病毒運(yùn)動(dòng)和復(fù)制所必需的蛋白；而RNA2則較短， 僅3564nt，編碼4個(gè)蛋白，其中3個(gè)與病毒外殼蛋白有關(guān)，另一個(gè)則是富含半胱氨酸的RNA沉 默抑制子。在自然條件下，中國小麥花葉病毒，由土壤專性寄生的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis)傳播，該類病毒在真菌介體的休眠孢子中存活數(shù)載，這給該類病害的防控帶來了 嚴(yán)重困難。由于其介體禾谷多黏菌高度專性寄生，十分難以人工體外培養(yǎng);在自然條件下， 禾谷多黏菌種群復(fù)雜多樣，加之土壤中微生物群落復(fù)雜多樣，也難以獲得高效傳播CWMV的 禾谷多黏菌純系，因此，CWMV自然條件下的介體傳播接種模式至今仍然無法在實(shí)驗(yàn)室條件 下進(jìn)行，這給CWMV及相關(guān)病毒的深入研究和生物學(xué)特性分析帶來了困擾;另一方面，CWMV雖 然能夠摩擦接種，但其效率有限，也難以在抗病篩選和CWMV深入研究中發(fā)揮作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種簡單快速高效的接種中國小麥花葉 病毒的方法及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案:一種快速高效的接種中國小麥花葉病毒 的方法，包括以下步驟：
[0005] 1)引物設(shè)計(jì):通過本實(shí)驗(yàn)室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列 共設(shè)計(jì)4條引物，引物序列見表1，其中引物對Rlf/Rlr用于擴(kuò)增RNA1，引物對R2f/R2r用于擴(kuò) 增RNA2;
[0006] 2)病毒基因組擴(kuò)增反應(yīng)：以病毒基因組cDNA作模板，采用高保真的Phusior#DNA聚 合酶(NEB)進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物對Rif/Rlr擴(kuò)增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對R2f/R2r擴(kuò)增 的RNA2產(chǎn)物長約3.6-kb;
[0007] 3)病毒基因組克?。翰《救L基因組RNA1、RNA2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，采用In-Fusion克隆試劑盒(Clontech)參照商家說明書分別連接至線性化的雙元載體質(zhì)粒上，測序 驗(yàn)證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組雙元載體質(zhì)粒，然后利用電轉(zhuǎn)化儀將含 RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌；
[0008] 4)人工接種:將含有CWMV基因組的農(nóng)桿菌等量混合，然后通過注射器將農(nóng)桿菌混 合液浸潤入植物體內(nèi)，2周后進(jìn)行病毒分子檢測并觀測植株表型變化；
[0009] -種快速高效的接種中國小麥花葉病毒的方法的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0010] 病毒溫敏性分析:經(jīng)人工接種CWMV的植株，分別置于12、15、17、20、25°C條件下繼 續(xù)培養(yǎng)，二周后進(jìn)行病毒分子檢測并分析病毒在不同溫度下的復(fù)制等特性。
[0011]表1本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物
[0012] '[0013]發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明針對當(dāng)前中國小麥花葉病毒研究技術(shù)的難點(diǎn)，發(fā)展建 立了一種簡單快速高效的人工接種CWMV的方法，并成功地應(yīng)用于CWMV的溫敏特性分析，本 方法可廣泛應(yīng)用于病毒生物學(xué)特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
【附圖說明】
[0014] 圖1:不同溫度條件下病毒RNA在接種葉片和系統(tǒng)葉片中的積累。其中，RNA1和RNA2 分別表示CWMV的第一、二條基因組片段;sgRNA表示亞基因組RNA; rRNA表示核糖體RNA;
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0016] 實(shí)施例1 一種高效的人工接種CWMV的方法及其溫敏性分析。
[0017] 引物設(shè)計(jì):通過本實(shí)驗(yàn)室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共 設(shè)計(jì)4條引物，引物序列見表1，其中引物對Rif/Rlr用于擴(kuò)增RNA1，引物對R2f/R2r用于擴(kuò)增 RNA2〇
[0018] 病毒基因組擴(kuò)增反應(yīng)：以病毒基因組cDNA作模板，采用高保真的PhusioWDNA聚合 酶(NEB)進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物對Rif/Rlr擴(kuò)增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對R2f/R2r擴(kuò)增的 RNA2產(chǎn)物長約3.6-kb;
[0019] 病毒基因組克隆：病毒全長基因組RNA1、RNA2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，采用In-Fusion克隆試劑盒(Clontech)參照商家說明書分別連接至線性化的雙元載體質(zhì)粒，測序驗(yàn) 證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組雙元載體質(zhì)粒，然后利用電轉(zhuǎn)化儀將含RNA1 和RNA2全長cDNA片段的重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌；
[0020] 人工接種：將含有CWMV基因組的農(nóng)桿菌等量混合，然后通過注射器將農(nóng)桿菌混合 液浸潤入植物體內(nèi)，2周后進(jìn)行病毒分子檢測并觀測植株表型變化。
[0021] 病毒溫敏性分析:經(jīng)人工接種CWMV的植株，分別置于12、15、17、20、25°C條件下繼 續(xù)培養(yǎng)，2周后進(jìn)行病毒分子檢測并分析病毒在不同溫度下的復(fù)制等特性。
[0022]結(jié)果分析：利用本發(fā)明的方法接種植物，接種效率可達(dá)到100%，而且所有接種 CWMV的植株都產(chǎn)生典型的花葉癥狀，分子檢測顯示通過本方法接種的CWMV在植物體內(nèi)能夠 正常滴進(jìn)行蛋白表達(dá)、基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、病毒粒子裝配;本實(shí)驗(yàn)室前期調(diào)查顯示CWMV在自 然條件下的發(fā)病嚴(yán)重程度與溫度有密切相關(guān)，為了分析CWMV的這一特點(diǎn)，我們特別利用本 發(fā)明的方法接種CWMV后，然后在不同溫度條件下培養(yǎng)，2周后進(jìn)行分子檢測，結(jié)果見圖1，在 接種葉片中CWMV RNA在12°C條件下積累量最大，其次為15°C條件，而在25°C條件下病毒RNA 積累量則少得多，表明較低溫有利于CWMV在接種葉片的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄及積累，而較高溫度下 則不利于CWMV RNA在接種葉片中的積累;在植株上部未接種葉片中，病毒RNA積累量在17°C 條件下最多，其次為15°C條件，而在較低溫度（12°C)和較高溫度(20和25°C)條件下則沒有 檢測到病毒RNA的積累信號，表明在15-17°C溫度最有利于CWMV的系統(tǒng)侵染，而較低和較高 的溫度均不利于CWMV的系統(tǒng)侵染。綜合起來看，低溫有利于CWMV的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，但溫度在 15-17°C時(shí)更適合CWMV的系統(tǒng)侵染。因此，本發(fā)明針對當(dāng)前中國小麥花葉病毒研究技術(shù)的難 點(diǎn)，不僅提供了一種簡單快速高效的人工接種CWMV的方法，還成功地應(yīng)用于CWMV的溫敏特 性分析，為深入研究CWMV的溫敏性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本發(fā)明也可廣泛應(yīng)用于病毒生物 學(xué)特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
[0023]除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法，包括以下步驟： 1) 引物設(shè)計(jì):通過本實(shí)驗(yàn)室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共設(shè) 計(jì)4條引物，其中引物對Rif/Rlr用于擴(kuò)增RNA1，引物對R2f/R2r用于擴(kuò)增RNA2; 2) 病毒基因組擴(kuò)增反應(yīng)：以病毒基因組cDNA作模板，采用高保真的PhusionDNA聚合酶 進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物對Rlf/Rlr擴(kuò)增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對R2f/R2r擴(kuò)增的RNA2產(chǎn) 物長約3.6-kb; 3) 病毒基因組克隆：病毒全長基因組RNA1、RNA2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，采用In-Fusion克隆試劑盒參照商家說 明書分別連接至線性化的雙元載體質(zhì)粒上 ，測序驗(yàn)證獲得分 別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組雙元載體質(zhì)粒，然后利用電轉(zhuǎn)化儀將含RNA1和RNA2全 長cDNA片段的重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌； 4) 人工接種:將含有中國小麥花葉病毒基因組的農(nóng)桿菌等量混合，然后通過注射器將 農(nóng)桿菌混合液浸潤入植物體內(nèi)，2周后進(jìn)行病毒分子檢測并觀測植株表型變化。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法的應(yīng)用，包括以下步 驟:經(jīng)人工接種中國小麥花葉病毒的植株，分別置于12、15、17、20、25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，二 周后進(jìn)行病毒分子檢測并分析病毒在不同溫度下的復(fù)制等特性。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法，應(yīng)用一套4條病毒基因組特異性引物(基因序列如序列表所示)以病毒基因組cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至線性化雙元載體，將重組的雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌并接種植物并用于CWMV的溫度敏感性分析，結(jié)果分析顯示本接種方法不僅能夠獲得CWMV侵染的植物病株，而且十分高效，表明本方法適用于中國小麥花葉病毒的接種，可用于相關(guān)病毒生物學(xué)特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
【IPC分類】C12N15/84
【公開號】CN105441480
【申請?zhí)枴緾N201610005687
【發(fā)明人】張恒木, 羊健, 張芬, 李靜, 陳劍平
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2016年1月4日