用于鑒別小麥葉銹菌和桿銹菌的抗原及多克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于鑒別小麥葉誘菌和桿誘菌的抗原及多克隆抗體，屬于植物病害防 治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥誘?。≒ucciniareconditaRob.e址esm.f.sp.triticiErikss.litHenn.)是由 小麥誘菌引致的真菌性病害，該病害是中國乃至全世界所有產(chǎn)麥國家的一類重要病害，嚴(yán) 重發(fā)生時(shí)會(huì)造成15%W上的產(chǎn)量損失。
[0003] 長期W來，小麥誘病的預(yù)測預(yù)報(bào)主要基于定期、大規(guī)模的田間病情調(diào)查和室內(nèi)病 菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。不僅耗時(shí)費(fèi)工，而且其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度也在很大程 度上取決于調(diào)查測報(bào)人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)，難W滿足快速、高通量診斷檢測的實(shí)際需求。 特別是在小麥葉誘菌的潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀察，難W界定初侵染的時(shí)期和規(guī) 模。因此，有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù)，研發(fā)簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥葉誘菌快速診斷和檢 測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為滿足上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種用于檢測小麥葉誘菌的抗原W及多克隆 抗體。
[0005] 本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種用于制備區(qū)分小麥葉誘菌和小麥桿誘菌的多克隆抗體的抗原多膚，其氨基酸 序列如沈QIDNO:1所示。
[0007] -種用于制備區(qū)分小麥葉誘菌和小麥桿誘菌的多克隆抗體的免疫原，其特征在 于，W權(quán)利要求1所述的抗原多膚為半抗原制備而得。
[0008] 所述免疫原的制備方法是：取權(quán)利要求1所述的抗原多膚6mg，用ImLDMF溶解， 得到溶液A;取15mgEDC和畑S，用0. 2血閒5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下 攬拌2地，即可得到反應(yīng)液B;稱取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8血0. 1M PH7. 2PBS中，將反應(yīng)液B逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攬拌2地，在4°C下，用 0.Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液；分裝，保存于-20°C備用。
[0009]用于區(qū)分小麥葉誘菌和小麥桿誘菌的多克隆抗體，其特征在于，W權(quán)利要求2或3 所述的免疫原對家兔進(jìn)行免疫制備而得。
[0010] 權(quán)利要求4所述的多克隆抗體的制備方法，步驟如下：
[0011] (1)W權(quán)利要求2或3所述的免疫原免疫家兔，檢測篩選高效價(jià)的免疫家兔；
[0012] (2)對選中的家兔采取全血，純化獲得多克隆抗體。
[0013] 所述免疫家兔的免疫次數(shù)為7次，所述檢測篩選免疫的家兔指采用elisa方法對 誘菌抗原檢測效價(jià)達(dá)到2WW上的免疫家兔。
[0014] 權(quán)利要求4所述的多克隆抗體在區(qū)分小麥葉誘菌和小麥桿誘菌中的應(yīng)用，其特征 在于，用權(quán)利要求4所述的多克隆抗體與待測樣品進(jìn)行反應(yīng)，觀察反應(yīng)結(jié)果，若為陰性，貝U所述樣品為小麥葉誘菌。
[0015] 所述反應(yīng)包括Elisa,Western-blot,免疫巧光試驗(yàn)。
[0016] 本發(fā)明對小麥葉誘菌特有蛋白（HAD-supe;rfamilysubfamilyIIAhy化olase，其 氨基酸序列如SEQIDNO:2所示）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)、免疫原性、親疏水性等特性進(jìn)行分析，選 擇了其中一段，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，人工合成。
[0017] 將人工合成的抗原多膚與BSA偶聯(lián)制備免疫原。
[0018] 采用獲得的免疫原免疫家兔，多次免疫經(jīng)效價(jià)檢測，選擇效價(jià)達(dá)到理想值的家兔， 收集其抗血清。用蛋白純化柱純化抗血清獲得多克隆抗體。
[0019] 對純化后的抗體進(jìn)行競爭免疫抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，獲得的多克隆抗體與天 然桿誘菌抱子進(jìn)行免疫反應(yīng)為陽性，與天然葉誘菌抱子進(jìn)行免疫反應(yīng)為陰性。
[0020] 本發(fā)明用于區(qū)分小麥葉誘菌和小麥桿誘菌的方法，操作十分簡便，只需取誘菌抱 子與本發(fā)明抗體在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，如果出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則該樣品是小麥桿誘 菌。整個(gè)過程無需儀器，技術(shù)人員可W攜帶相關(guān)試劑和耗材，在野外就能完成兩種誘病的鑒 另IJ，能夠簡便有效地檢測是否發(fā)生葉誘菌早期感染。
【附圖說明】
[0021] 圖1.多克隆抗體的制備流程圖，
[0022] 免疫時(shí)間安排：如表2所示，初次免疫15天后進(jìn)行第二次免疫，15天后進(jìn)行第Ξ 次免疫，7天后第一次采血檢測，7天后進(jìn)行第四次免疫，7天后第二次采血檢測，7天后進(jìn)行 第五次免疫，7天后第Ξ次采血檢測，W此類推，每組均完成至少6次免疫與4次采血檢測。 其中，E004組的實(shí)驗(yàn)兔子免疫效果較好，為本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選組，其免疫時(shí)間安排如表3所 /J、-〇
[0023] 圖2.純化所得的多克隆抗體檢測圖，
[0024] 從左至右依次為：Marker、血清樣、純化樣，上樣量約10微克/孔，抗體大小在 150kDa~ISOkDa之間。
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，需要理解的是，下述實(shí)施例僅 作為解釋和說明，而不W任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 表1本實(shí)施例所用菌種
[0027]
[0028]W下實(shí)施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可W通過本領(lǐng)域 常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級即可。
[0029] 實(shí)施例1.用于鑒別桿誘菌的多克隆抗體制備
[0030] 試劑與溶液：
[0031] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）
[0032]憐酸鹽緩沖液（PBS，0. 02M，pH7. 2)，
[0033]包被液（憐酸鹽緩沖液，0. 05M，pH7. 4)，
[0034]反應(yīng)稀釋液任851'，抑7.4,0.031，+0.05%吐溫20)，
[0035] 洗涂工作液（用去離子水將20X濃縮洗涂液按1 :19體積比進(jìn)行稀釋）；
[0036]封閉液（在 0. 02mol/LPBST中加入 0. 05%BSA)，
[0037] 底物顯色液：由A液和B液組成，A液為過氧化氨，B液為四甲基聯(lián)苯胺；
[0038]終止液（2mol/LH2SO4)，
[0039] 酶標(biāo)二抗（北京勤邦生物）：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IGg抗體
[0040] 表1所示的4種誘菌，每種誘菌的懸液1*1〇5抱子/ml
[0041] 主要儀器設(shè)備：
[0042] 真空冷凍干燥機(jī)，電熱恒溫培養(yǎng)箱，ProteinA/G柱，電泳槽、電泳儀，酶標(biāo)板，酶標(biāo) 儀，低溫高速離屯、機(jī)，ProteinA層析柱等。
[0043] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大耳兔，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。
[0044] 1、多膚合成
[0045]根據(jù)小麥葉誘菌特有蛋白（HAD-supe;rfamilysubfamilyIIAhy化olase)序列 佛QIDNO:
[0046] 2)設(shè)計(jì)多膚，篩選獲得抗原多膚，其氨基酸序列為：CGVFKGNKPEDA，委托北京勤邦 生物技術(shù)有限公司對上述抗原蛋白進(jìn)行化學(xué)合成，獲得半抗原。
[0047] 2、免疫原和包被原制備
[0048] (1)半抗原與牛血清白蛋白度SA)偶聯(lián)形成免疫原
[0049] 取步驟1獲得的半抗原6mg，用1血DMF溶解，得到溶液A;取15mgEDC和畑S，用 0. 2血MES(P冊.0)充分溶解后，加入溶液A中，室溫下攬拌2地，即可得到反應(yīng)液B。稱取牛 血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8血0. 1MPBS(PH7. 2)中，將反應(yīng)液B逐滴緩慢 滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攬拌2地，在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3d，每天換3次 透析液。分裝，保存于-20°C備用。
[0050] (2)半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)形成包被原
[005。取步驟1獲得的半抗原4mg，用1血DMF溶解，得到溶液A;取2. 5 %的戊二醒 200ul，加入A溶液，反應(yīng)30min即可得到反應(yīng)液B。稱取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在 3.8mL0. 1MCB液中，將反應(yīng)液B逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攬拌16h，再加入 棚氨化鋼還原反應(yīng)2小時(shí)，然后在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3d，每天換3次透析液。分 裝，保存于-20°C備用。
[0052] 3、多抗制備
[0053] 免疫原：將步驟2獲得的免疫原，與弗氏完全佐劑按1:1體積比混勻后對實(shí)驗(yàn)兔子 進(jìn)行初次免疫，W后每次免疫采用弗氏不完全佐劑與免疫原按1:1體積比混勻后進(jìn)行。共 制備了 7個(gè)免疫原，分別進(jìn)行免疫。
[0054] 免疫劑量：初次免疫0. 2mg/次/只，第二次開始0.1 mg/次/只。