NEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。采用 美國Agilent公司的人全基因表達譜芯片（4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h， 然后洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0070] 6、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0071] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點后，將數(shù)據(jù)導入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2. 0或小于0. 5的基因作為差異表達基因。
[0072] 7、統(tǒng)計學處理
[0073] 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法， P〈0. 05差異有顯著性意義。
[0074] 8、結果
[0075] 結果如圖1顯示，與正常人相比，急性心肌梗死患者血液中DSG3基因的mRNA水平 顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 05)。
[0076] 實施例2QPCR實驗驗證急性心肌梗死患者和正常人中差異表達的基因
[0077] 1、研究對象：
[0078] 收集體檢健康者40例（正常對照組），選擇門診急性心肌梗死患者40例。男女不 限，年齡不限。AMI患者均符合1979年國際心臟病學會和協(xié)會及WHO臨床命名標準化聯(lián)合 專題組制定的標準。所有患者均排除惡性腫瘤、急性感染、外傷及嚴重肝、腎疾病、腦栓塞、 肺栓塞、下肢靜脈栓塞、DIC和急性腎功能不全等疾病。
[0079] 所有研究對象對本研究均知情并簽署了知情同意書。
[0080] 2、采血方法
[0081] 步驟同實施例1。
[0082] 3、血液中總RNA的提取
[0083] 步驟同實施例1。
[0084] 4、逆轉(zhuǎn)錄
[0085] 用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對1 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25 μ 1反應體系，每 個樣品取1 μ g總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5 X逆轉(zhuǎn)錄緩 沖液，lOmmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV，模板 RNA。 42°C孵育lh，72°C lOmin，短暫離心。
[0086] 5、QPCR
[0087] (I)引物設計
[0088] 根據(jù)Genbank中DSG3基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海 生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0089] DSG3 基因：
[0090] 正向引物為 5' -GTGGTCATATTGGTTCAT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0091] 反向引物為 5' -AGTTATCTTCTCCTTCTCT-3'（SEQ ID NO. 4)，
[0092] GAPDH 基因：
[0093] 正向引物為 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0094] 反向引物為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0095] (2)按照表1配制PCR反應體系：
[0096] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0097] 表1PCR反應體系
[0099] (3)卩〇?反應條件：95°(：1011^11，（95°(：108,601€408)*45個循環(huán)。以5￥81?6代611 作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和 電泳確定目的條帶，△ ACT法進行相對定量。
[0100] 6、統(tǒng)計學方法
[0101] 結果數(shù)據(jù)都是以平均值土標準差的方式來表示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行 統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0. 05時具有統(tǒng)計學意義。
[0102] 7、結果
[0103] 結果如圖2所示，與正常人相比，急性心肌梗死患者血液中DSG3基因的mRNA水平 顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 05)，結果同基因芯片實驗。
[0104] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 檢測DSG3基因表達的產(chǎn)品在制備診斷急性心肌梗死的工具中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量 PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測DSG3基因表達水平以診斷急性心肌 梗死的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品 至少包括一對特異擴增DSG3基因的引物；所述用實時定量PCR診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品至 少包括一對特異擴增DSG3基因的引物；所述用免疫檢測診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：與 DSG3蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：與DSG3基 因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯 片；其中，蛋白芯片包括與DSG3蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與DSG3基因的核酸 序列雜交的探針。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷急性心肌梗死的 產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增DSG3基因的引物如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。5. -種用于診斷急性心肌梗死的工具，其特征在于，所述工具能夠通過檢測樣本中 DSG3基因的表達來診斷急性心肌梗死。6. 根據(jù)權利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通 量測序平臺。7. 根據(jù)權利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所 述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用 于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對DSG3基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載 體以及固定在固相載體的DSG3蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋 白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋 白免疫檢測試劑盒包括DSG3蛋白的特異性抗體；所述試紙包括用于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水 平的試劑；所述高通量測序平臺包括用于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑。8. 根據(jù)權利要求7所述的工具，其特征在于，所述檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括 針對DSG3基因的引物和/或探針。9. 根據(jù)權利要求8所述的工具，其特特征在于，所述針對DSG3基因的引物序列如下： 正向引物序列如SEQIDNO. 3所示，反向引物如SEQIDNO. 4所示。10. 根據(jù)權利要求5-9中任一項所述的工具，其特征在于，所述樣本是血液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了DSG3基因可以作為急性心肌梗死早期診斷的分子標志物。本發(fā)明利用基因芯片和QPCR的方法發(fā)現(xiàn)DSG3基因在正常人和急性心肌梗死患者的血液中的表達存在顯著差異，即可以通過檢測血液中DSG3基因表達情況來判斷受試者是否患有急性心肌梗死。根據(jù)兩者的相關性，本發(fā)明開發(fā)了一種診斷急性心肌梗死的試劑盒，該試劑盒通過檢測DSG3基因的表達從而進行急性心肌梗死的診斷。本發(fā)明的診斷試劑盒可用于疾病的早期診斷，在臨床上具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, A61K45/06, G01N33/68, A61P9/10
【公開號】CN105400880
【申請?zhí)枴緾N201510923782
【發(fā)明人】曹月娟, 李榮慶, 李陽春, 張濤, 吳楠, 張鳳萍, 張建艷, 郭兆增
【申請人】天津市人民醫(yī)院
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月11日