;1:;[〇111(;[1：￥61\2(^&1^抑-13；[〇(株）））（1〇4 1^)混合12小時，在 16°C進(jìn)行培育，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接。 將大腸桿菌JM109株接種于LB培養(yǎng)基lmL，在37°C進(jìn)行5小時需氧地前培養(yǎng)，將該培養(yǎng) 物0. 4mL加入到SOB培養(yǎng)基40mL (2 %細(xì)菌用胰蛋白胨，0. 5 %細(xì)菌用酵母提取物，IOmMNaCl， 2. 5mMKCl，ImMMgSO4, ImMMgCl2)中，在18°C培養(yǎng)20小時。將該培養(yǎng)物通過離心分離來集菌 后，加入冷 TF 溶液（20mM PIPES-K0H(pH6.0)，200mM KCl，10mM CaC12,40mM MnC12)13mL， 在〇°C放置10分鐘。然后，再次離心，除去上清液后，將沉淀的大腸桿菌懸浮于冷TF溶液 3. 2mL，加入0· 22mL的二甲亞砜在0°C放置10分鐘。 在這樣制作的感受態(tài)細(xì)胞（competent cell) 200 μ L中加入上述的連接溶液10 μ L，在 〇°C放置30分鐘后，在42°C施與30秒熱激，在(TC冷卻2分鐘后，添加 SOC培養(yǎng)基（20mM葡 萄糖，2%細(xì)菌用胰蛋白胨，0.5%細(xì)菌用酵母提取物，IOmM NaCl，2. 5mM KC1，ImM MgSO4, ImM MgCl2) lmL，在37°C振蕩培養(yǎng)1小時。 培養(yǎng)后，每次100 μ L分次涂布于LBAmp瓊脂培養(yǎng)基（含有氨芐西林100mg/L，1. 5 %瓊 脂的LB培養(yǎng)基），進(jìn)一步在37°C培養(yǎng)。將在瓊脂培養(yǎng)基上生長的多個轉(zhuǎn)化體菌落用I. 5mL 的LBAmp培養(yǎng)基（含有氨芐西林100mg/L的LB培養(yǎng)基）在37°C培養(yǎng)一晚，集菌后使用 QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN 公司）調(diào)制質(zhì)粒 DNA。 關(guān)于所得的重組質(zhì)粒DNA，將其堿基序列使用CEQ DTCS Quick Start Kit和熒光定 序儀CEQ 2000XL DNA Analysis(都是BECKMAN COULTER，美國）進(jìn)行確認(rèn)，命名為質(zhì)粒 pMMAOll。使用質(zhì)粒pMMAOll將大腸桿菌JM109株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作脫水酶表達(dá)重組體。 實施例2 使用了編碼紅串紅球菌PR4(NBRC100887)來源的脫水酶的基因表達(dá)大腸桿菌重組體 細(xì)胞提取液的、從3-羥基異丁酸-CoA開始的甲基丙烯酰-CoA的合成 1)具有脫水酶活性的細(xì)胞破碎液的調(diào)制 將實施例1中獲得的導(dǎo)入了編碼脫水酶的基因的大腸桿菌重組體JM109/pMMA011接 種于2ml的LBAmp培養(yǎng)基，在37°C進(jìn)行24小時前培養(yǎng)。取培養(yǎng)液0. lml，加入到包含ImM IPTG的100mL相同培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)24小時。從所得的培養(yǎng)液通過離心分離 (3, 700 X g，10分鐘，4°C )回收菌體，用IOmM磷酸-鈉緩沖液（ρΗ7·0)洗滌2次后，在相同 緩沖液中懸浮使得〇D630nm為6。 從所得的菌體懸浮液如下所示調(diào)制Iml細(xì)胞破碎液。使用超聲波式均化器 VP-300(taitec，日本），在輸出（振幅）：15%/On :1秒，off :1秒的條件下一邊用冰冷卻一 邊破碎5分鐘。 2)使用了編碼脫水酶的基因表達(dá)大腸桿菌重組體細(xì)胞破碎液的甲基丙烯酰-CoA合成 反應(yīng) 在 1.0 M Tris-鹽酸緩沖液（ρΗ7· 4) 0· 05ml、5mM 3-羥基異丁酰-CoA 0· 2ml 和水 0. 65ml混合而得的混合物中，加入如上所述獲得的具有烯?；鵆oA脫水酶活性的細(xì)胞破碎 液0. lml，調(diào)整成Iml反應(yīng)液。在37°C反應(yīng)3小時，在以下所示的HPLC條件下進(jìn)行分析。其結(jié) 果是，確認(rèn)了 0. 6mM的甲基丙烯酰-CoA的生成。此時，3-羥基異丁酰-CoA殘存量為0. 33mM。 從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的轉(zhuǎn)變率為65% ( = 0. 6八0. 33+0. 6) X 100)。 (HPLC分析條件） 柱：Capcell Pak 0DS-UG120(shiseido)，2.0mmX250mm 流動相：25% Me0H，50mM H3PO4, ρΗ5· 7 流量：1. 〇ml/min 柱溫度：40 °C 檢測：UV 254nm 進(jìn)樣量10 μ 1 (將反應(yīng)溶液用流動相稀釋10倍） 實施例3 導(dǎo)入了編碼綠膿桿菌PAOl (NBRC106052)來源的脫水酶的基因的大腸桿菌重組體的制 作 <來自假單胞菌屬的基因組DNA的調(diào)制> 從用IOml的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)了的綠膿桿菌PAOl株，與實施例1同樣地操作來取得 基因組DNA。 <脫水酶表達(dá)用質(zhì)粒的制作> 使用下述的寡核苷酸引物，以上述中獲得的綠膿桿菌PAOl (NBRC106052)株基因組DNA 作為模板，與實施例1同樣地操作，將包含推定編碼脫水酶的基因的DNA片段（約0. 8kb) 擴(kuò)增。 寡核苷酸引物： MMA-025 :5' -GGTCATGAACACTGCCGTCGAACCCTACAAG-3'（序列號 7) MMA-026 :5' -GGCCTGCAGGCTCAGCAGTTGCGCCACTTGGGATC-3'（序列號 8) 將該DNA片段用BspHI和Sse8387I消化后，與實施例1同樣地操作，并入到載體 pTrc99A中。將所得的質(zhì)粒命名為pMMA015。使用質(zhì)粒pMMA015將大腸桿菌JM109株進(jìn)行 轉(zhuǎn)化，制作脫水酶表達(dá)重組體。 實施例4 使用了編碼綠膿桿菌PAOl (NBRC106052)來源的脫水酶的基因表達(dá)大腸桿菌重組體細(xì) 胞提取液的、從3-羥基異丁酸-CoA開始的甲基丙烯酰-CoA的合成 1) 具有脫水酶活性的細(xì)胞破碎液的調(diào)制 使用與實施例2的1)記載的方法同樣的方法將實施例3中獲得的導(dǎo)入了脫水酶基因 的大腸桿菌重組體JM109/pMMA015進(jìn)行培養(yǎng)和菌體的回收，獲得了菌體懸浮液。使用與實 施例2的1)記載的方法同樣的方法從所得的菌體懸浮液調(diào)制細(xì)胞破碎液。 2) 使用了脫水酶基因表達(dá)大腸桿菌重組體細(xì)胞破碎液的甲基丙烯酰-CoA合成反應(yīng) 在將LOM Tris-鹽酸緩沖液（pH7. 4)0. 05ml、5mM 3-羥基異丁酰-CoA 0.2ml和水 0. 65ml混合而得的混合物中，加入如上所述獲得的具有烯?；鵆oA脫水酶活性的細(xì)胞破碎 液0. lml，調(diào)整成反應(yīng)液lml。在37°C反應(yīng)3小時，在實施例2的2)所示的HPLC條件下 進(jìn)行分析。其結(jié)果是確認(rèn)了 〇.6mM的甲基丙烯酰-CoA的生成。此時，3-羥基異丁酰-CoA 殘存量為〇. 37mM。從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的轉(zhuǎn)變率為62 % ( = 0. 6/ (0· 37+0. 6) X 100) 〇 序列表自由內(nèi)容（free text) 序列號5 :MMA-031 序列號6 :MMA-032 序列號7 :MMA-025 序列號 8 :MMA-026。
【主權(quán)項】
1. 一種甲基丙烯酰-CoA的制造方法，在脫水酶的存在下，將3-羥基異丁酰-CoA向甲 基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，使用從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的 轉(zhuǎn)變率為50%以上的脫水酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制造方法，在pH4~10的反應(yīng)條件下向甲基丙烯酰-CoA 轉(zhuǎn)變。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項所述的制造方法，在溫度5~80°C的反應(yīng)條件下向甲 基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項所述的制造方法，在時間1分鐘~1周的反應(yīng)條件下 向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項所述的制造方法，3-羥基異丁酰-CoA由包含ImM以 上滲透壓調(diào)節(jié)劑的水性介質(zhì)調(diào)制而得。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6的任一項所述的制造方法，在表達(dá)編碼脫水酶的基因的轉(zhuǎn)化體 的存在下，將3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制造方法，編碼脫水酶的基因是微生物來源的基因。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制造方法，微生物為屬于假單胞菌屬或紅球菌屬的微生物。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制造方法，脫水酶選自由下述（a)~（f)所組成的組， (a)包含序列號1或3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b) 包含在序列號1或3所示的氨基酸序列中缺失、置換、附加和/或插入了 1個或幾 個氨基酸的氨基酸序列，并且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)； (c) 與包含序列號1或3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)顯示90%以上的同一性，并且具 有脫水酶活性的蛋白質(zhì)； (d)由包含序列號2或4所不的喊基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)； (e)由與包含序列號2或4所示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交的DNA編碼，并 且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)； (f)由與包含序列號2或4所示的堿基序列的DNA顯示90%以上的同一性的DNA編碼， 并且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)。11. 一種甲基丙烯酰-CoA的制造方法，在表達(dá)編碼微生物來源的脫水酶的基因的轉(zhuǎn)化 體的存在下，使由包含ImM以上滲透壓調(diào)節(jié)劑的水性介質(zhì)調(diào)制而得的3-羥基異丁酰-CoA 水溶液，在pH4~10、溫度5~80°C、時間1分鐘~1周的反應(yīng)條件下反應(yīng)，從而以轉(zhuǎn)變率 50%以上將3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。
【專利摘要】本發(fā)明中，作為采用酶催化劑的甲基丙烯酰-CoA的制造方法，提供通過具有脫水酶活性的酶，將3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變的甲基丙烯酰-CoA的制造方法。在該制造方法中，具有脫水酶活性的酶的從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的轉(zhuǎn)變率為50％以上。此外，在該制造方法中，具有脫水酶活性的酶可以為屬于假單胞菌屬或紅球菌屬的微生物來源的酶。
【IPC分類】C12N9/88, C12N15/09, C12P19/32
【公開號】CN105378098
【申請?zhí)枴緾N201480039902
【發(fā)明人】佐藤榮治, 湯不二夫, 中島永二, 山崎倫子, 水無涉
【申請人】三菱麗陽株式會社
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年7月25日
【公告號】EP3029145A1, US20160145665, WO2015015784A1