min之間的每30min)來確定我們發(fā)現(xiàn)高對照 的最低基礎(chǔ)信號的時間。使用在此時間（Tx)的信號減去在450min處的信號。結(jié)果以RFU 表示為在T450與Tx之間的差異。
[0383] 通過最小二乘法根據(jù)對照最小％對化合物濃度圖擬合最佳擬合曲線。由此可以獲 得IC5。值（引起50%活性抑制的抑制濃度）。
[0384] LC =低對照值的中位值
[0385] =低對照：沒有酶的情況下的反應(yīng)
[0386] HC =高對照值的中位值
[0387] =高對照：有酶的情況下的反應(yīng)
[0388] 作用 ％ = 100-[(樣品-LC) AHC-LC) *100]
[0389] 對照％ =(樣品 /HC)*100
[0390] 對照最小％ =(樣品-LC) AHC-LC)*100
[0391] 以下示例性化合物基本上如以上所述地進(jìn)行測試并且展現(xiàn)以下活性：
[0392] 表 5.
[0393]
[0394]
[0395] n.t.意指未測試。
[0396] SKNBE2細(xì)朐中的BACE1細(xì)朐a Lisa測宙
[0397] 在兩個a Lisa測定中，對產(chǎn)生并分泌到人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SKNBE2細(xì)胞的培養(yǎng)基中 的總Αβ和Αβ1-42水平進(jìn)行定量。該測定是基于表達(dá)野生型淀粉樣前體蛋白（hAPP695) 的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SKNBE2。將這些化合物稀釋并且添加到這些細(xì)胞中，孵育18小時并且隨 后進(jìn)行Αβ 1-42和總Αβ的測量。通過夾心a Lisa測量總Αβ和Αβ 1-42。a Lisa是一 種針對總Αβ和Αβ 1-42的檢測分別使用附接到鏈霉親和素包被的珠球上的生物素化抗體 AbN/25和偶聯(lián)受體珠球的抗體Ab4G8或cAb42/26的夾心測定。在總Α β或Α β 1-42的存 在下，這些珠球緊密靠近。供體珠球的激發(fā)引起單線態(tài)氧分子的釋放，這觸發(fā)受體珠球中的 級聯(lián)能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致光發(fā)射。在孵育1小時之后測量光發(fā)射（在650nm處激發(fā)并且在 615nm處發(fā)射）。
[0398] 通過最小二乘法根據(jù)對照最小％對化合物濃度圖擬合最佳擬合曲線。由此可以獲 得IC5。值（引起50%活性抑制的抑制濃度）。
[0399] LC=低對照值的中位值
[0400] =低對照：在a Lisa中，在沒有化合物、沒有生物素化Ab的情況下預(yù)孵育的細(xì)胞 a Lisa
[0401] HC =高對照值的中位值
[0402] =高對照：在沒有化合物的情況下預(yù)孵育的細(xì)胞
[0403] 作用 ％ = 100-[(樣品-LC) AHC-LC) *100]
[0404] 對照％ =(樣品 /HC)*100
[0405] 對照最?。?=(樣品-LC) AHC-LC)*100
[0406] 以下示例性化合物基本上如以上所述地進(jìn)行測試并且展現(xiàn)以下活性：
[0409] 基于BACE2牛物化學(xué)FRET的測宙
[0410] 此測定是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定（FRET)的測定。用于此測定的底物包 含淀粉樣前體蛋白（ΑΡΡ) β-分泌酶裂解位點(diǎn)的'瑞典' Lys-Met/Asn-Leu突變。此底物還 含有兩個熒光團(tuán)：（7-甲氧基香豆素-4-基）乙酸（Mca)是一種具有320nm的激發(fā)波長和 405nm的發(fā)射波長的熒光供體并且2,4-二硝基苯基（Dnp)是一種專有的淬滅劑受體。已選 擇這兩個基團(tuán)之間的距離，以使得在光激發(fā)后，供體熒光能量通過共振能量轉(zhuǎn)移被受體顯 著地淬滅。在被β -分泌酶裂解后，熒光團(tuán)Mca與淬滅基團(tuán)Dnp分離，恢復(fù)供體的全熒光產(chǎn) 額。熒光的增加與蛋白水解速率線性相關(guān)。
[0411] 簡言之，在384孔規(guī)格中，在化合物不存在或存在下，將0.4 μ g/ml最終濃度的重 組BACE2蛋白在室溫下與10 μ Μ底物一起在孵育緩沖液（pH 5. 0的50mM檸檬酸鹽緩沖液， 0.05%PEG，無 DMS0)中孵育450分鐘。接下來，通過在T = 0和T = 450處的熒光測量 (在320nm處激發(fā)并且在405nm處發(fā)射）而直接測量蛋白水解的量。結(jié)果以RFU(相對熒光 單位）表示為T450與T0之間的差異。
[0412] 通過最小二乘法根據(jù)對照最?。衔餄舛葓D擬合最佳擬合曲線。由此可以獲 得IC5。值（引起50%活性抑制的抑制濃度）。
[0413] LC =低對照值的中位值
[0414] =低對照：沒有酶的情況下的反應(yīng)
[0415] HC =高對照值的中位值
[0416] =高對照：有酶的情況下的反應(yīng)
[0417] 作用 ％= 100-[(樣品-LCV(HC_LC)*100]
[0418] 對照％ =(樣品 /HC)*100
[0419] 對照最?。?=(樣品-LC) AHC-LC)*100
[0420] 以下示例性化合物基本上如以上所述地進(jìn)行測試并且展現(xiàn)以下活性：
[0423] 體內(nèi)效力證明
[0424] 本發(fā)明的Αβ降低劑可以用于治療哺乳動物（例如人）的AD，或可替代地，在動物 模型（例如但不限于小鼠、大鼠或豚鼠）中證明效力。哺乳動物可以不被診斷為患有AD， 或可以不具有針對AD的遺傳易感性，但是可以是轉(zhuǎn)基因的，使得它以類似于在罹患AD的人 類中見到的方式過度產(chǎn)生并最終沉積Α β。
[0425] 可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法以任何標(biāo)準(zhǔn)形式給予Αβ降低劑。例如但不限于，Αβ降 低劑可以處于口服或通過注射攝入的液體、片劑或膠囊的形式。Αβ降低劑可以按足以顯著 降低在血液、血漿、血清、腦脊液（CSF)或腦中的Αβ的水平的任何劑量給予。
[0426] 為了確定Αβ降低劑的急性給藥是否會降低體內(nèi)Αβ水平，使用了非轉(zhuǎn)基因的嚙 齒動物，例如小鼠或大鼠。檢查用Αβ降低劑處理的動物并與未處理或用載體處理的那些 進(jìn)行比較，并且通過默沙東公司（Meso Scale Discovery，MSD)的電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)對可 溶性Α β 42、Α β 40、Α β 38以及Α β 37的腦水平進(jìn)行定量。處理周期從小時（h)至天變化， 并且一旦效應(yīng)起始時程可以確立，基于Αβ降低的結(jié)果調(diào)節(jié)處理周期。
[0427] 示出了用于測量體內(nèi)Αβ降低的一個典型實(shí)驗(yàn)方案，但這只是可以用來優(yōu)化可檢 出Αβ水平的許多變體中的一種。例如，Αβ降低化合物被配制到水中的2〇%Captisd_? (β-環(huán)糊精的磺丁基醚）中或20%羥丙基β環(huán)糊精中。以單次口服劑量或通過任何可接 受的給藥途徑向禁食過夜的動物給予這些Α β降低劑。在4h之后，處死這些動物并且分析 Αβ水平。
[0428] 通過斷頭術(shù)和放血將血液收集在EDTA-處理過的收集管中。將血液在4°C下以 1900g離心10分鐘（min)并且回收血漿并快速冰凍以用于后續(xù)分析。將腦從顱骨和后腦 上移除。移除小腦并且分開左半球和右半球。將左半球在_18°C下儲存以用于測試化合物 水平的定量分析。將右半球用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)緩沖液沖洗并且立即在干冰上冷凍并 在-80°C下儲存直到勻漿以用于生化測定。
[0429] 將來自非轉(zhuǎn)基因動物的小鼠腦重懸浮于含有蛋白酶抑制劑（羅氏公司 (Roche)-11873580001 或 04693159001)的每克組織 8 倍體積的 0. 4% DEA(二乙胺）/50mM NaCl中，例如，對于(λ 158g的腦，添加 L 264ml的(λ 4% DEA。在FastPr印-24系統(tǒng)（MP生 物醫(yī)學(xué)公司（MP Biomedicals))中使用溶解基質(zhì)D(MPBio#6913-100)在6m/s下持續(xù)20秒 將所有樣品勻漿。將勻漿在20800x g下離心5min并收集上清液。將上清液在221.300X g 下離心50min。然后將產(chǎn)生的高速上清液轉(zhuǎn)移至新的埃彭道夫管（eppendorftube)中。將 九份上清液用1份〇. 5M Tris-HCl (pH 6. 8)中和并用來定量Α β。
[0430] 為了定量Α β 42、Α β 40、Α β 38和Α β 37在腦勻漿的可溶級分中的量，使用MSD 的電化學(xué)發(fā)光多路檢測技術(shù)進(jìn)行對Αβ 42、Αβ 40、Αβ 38和Αβ 37的同時特異檢測。在 此測定中，在 MSD 4-plex 板上涂覆針對 Α β 37 (JRD/A β 37/3)、Α β 38 (J&JPRD/A β 38/5)、 Α β 40 (JRF/cA β 40/28)和Α β 42 (JRF/cA β 42/26)特異性的純化的單克隆抗體。簡言之， 在Ultraculture中的1. 5ml埃彭道夫管中制備標(biāo)準(zhǔn)品（合成的Α β 42、Α β 40、Α β 38以及 Α β 37的稀釋液），其中最終濃度范圍從10000至0. 3pg/m。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品與Sulfo標(biāo)簽標(biāo) 記的JRF/rA β /2抗體共孵育，該抗體標(biāo)記在Α β的N-末端作為檢測器抗體。然后將50 μ 1 的結(jié)合物/樣品或結(jié)合物/標(biāo)準(zhǔn)品混合物添加到抗體包被的板上。允許將該板在4°C下孵 育過夜以允許抗體-淀粉樣蛋白復(fù)合物的形成。根據(jù)制造商的說明書（默沙東公司，蓋瑟 斯堡（Gaitherburg)，馬里蘭州），在此孵育以及隨后的洗滌步驟之后，通過添加讀出緩沖 液（read buffer)來完成該測定。
[0431] 始于該電極的電化學(xué)刺激發(fā)生時SULF0-TAG發(fā)光。使用MSD扇形儀表SI6000用 于信號讀出。
[0432] 在此模式中，相比于未處理的動物Αβ降低是有利的，具體地具有至少10%的Αβ 降低，更具體地具有至少20%的Αβ降低。
[0433] 結(jié)果
[0434] 結(jié)果示于表8中（將針對作為對照（Ctrl)的未處理的動物的值設(shè)置在100):
[0435] 表 8.
[0436]
[0437] S. c意指皮下；ρ· 〇·意指口服
[0438] 預(yù)示組合物實(shí)例
[0439] 如在通篇的這些實(shí)例中使用的"活性成分"涉及具有化學(xué)式（I)的最終化合物、其 藥學(xué)上可接受的鹽、其溶劑化物以及立體化學(xué)異構(gòu)形式。
[0440] 用于本發(fā)明的配制品的配方的典型實(shí)例如下：
[0441] 1片齊1丨
[0442] 活性成分 5至50 mg 磷酸二-鈣 20 rag 乳糖 30 mg
[0443] 滑石 10 mg 硬臘酸鎂 5 mg 馬鈴薯淀粉_ .補(bǔ)足到200 nig
[0444] 在此實(shí)例中，可以將活性成分替代為相同量的根據(jù)本發(fā)明的任何化合物，特別是 相同量的任何示例性化合物。
[0445] 2.懸浮液
[0446] 制備水性懸浮液用于口服給予，使得每毫升包含1至5mg的這些活性化合物之一、 50mg的羧甲基纖維素鈉、lmg的苯甲酸鈉、500mg的山梨醇以及水（補(bǔ)足到lml)。
[0447] 3.可灃射劑
[0448] 通過攪拌在按體積計在水中的10%丙二醇中的按重量計1. 5%的本發(fā)明的活性 成分來制備腸胃外組合物。
[0449] 4.軟膏
[0450] 活性成分 5至1000 mg 硬脂醇 3 g 羊毛脂 5g 白凡士林 1.5 g 水 補(bǔ)足到100 g
[0451] 在此實(shí)例中，可以將活性成分替代為相同量的根據(jù)本發(fā)明的任何化合物，特別是 相同量的任何示例性化合物。
[0452] 合理的變化不應(yīng)被認(rèn)為偏離本發(fā)明的范圍。將顯而易見的是在此描述的發(fā)明可以 由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以許多方式改變。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有化學(xué)式（I)的化合物或其立體異構(gòu)形式，其中 ri選自W下各項(xiàng)的組：氨；面素；和C14烷基； R2選自W下各項(xiàng)的組：任選地被一個或多個各自獨(dú)立地選自W下各項(xiàng)的取代基取代的Cl4烷基：氣和C1 4烷氧基；W及C3 7環(huán)烷基； R3在每種情況下是一個獨(dú)立選擇的面素取代基；η是選自1和2的整數(shù)； R4選自（a)和化）：其中R郝R6各自獨(dú)立地選自W下各項(xiàng)的組：芳基和雜芳基，其各自可W任選地被一個 或多個各自獨(dú)立地選自W下各項(xiàng)的組的取代基取代：面素、-CN、任選地被一個或多個面素 取代基取代的。4烷基W及任選地被一個或多個面素取代基取代的C1 4烷氧基； 其中芳基是苯基； 其中雜芳基是一種選自下組的5元芳香族雜環(huán)，該組由W下各項(xiàng)組成：嗯挫和化挫；或 是一種選自下組的6元芳香族雜環(huán)，該組由W下各項(xiàng)組成：化晚基、喀晚基和化嗦基； 或其藥學(xué)上可接受的加成鹽或溶劑化物。2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Ri是氨或面素，并且其余的變量是如在權(quán)利要求 1中所定義的。3. 如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中R2是C1 4烷基或被一個或多個面素取代基取 代的。4烷基，并且其余的變量是如在權(quán)利要求1或2中所定義的。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中R4是 (a)其中R5是任選地被一個或多個各自獨(dú)立地選自W下各項(xiàng)的組的取代基取代的雜芳基： 面素、-CN、任選地被一個或多個面素取代基取代的。4烷基W及任選地被一個或多個面素 取代基取代的。4烷氧基； 其中雜芳基是一種選自嗯挫和化挫的5元芳香族雜環(huán)；或是一種選自下組的6元芳香 族雜環(huán)，該組由w下各項(xiàng)組成：化晚基、喀晚基和化嗦基； 并且其余的變量是如在權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物具有化學(xué)式（1')中所示的構(gòu) 型并且其中η、R、R\R2、R呀PR4是如在權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所定義的。6. -種藥物組合物，包括治療有效量的如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的化合物W 及一種藥學(xué)上可接受的載體。7. -種用于制備如權(quán)利要求6所定義的藥物組合物的方法，其特征在于將一種藥學(xué)上 可接受的載體與治療有效量的如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的化合物充分混合。8. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的化合物，或如權(quán)利要求6中所定義的藥物組合 物，用于用作一種藥劑。9. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的化合物或如權(quán)利要求6中所定義的藥物組合物 用于在治療或預(yù)防W下各項(xiàng)中使用：阿爾茨海默?。ˋD)、輕度認(rèn)知損傷（MCI)、記憶損傷、 衰老、癡呆、路易體癡呆、伴有漸進(jìn)性核麻搏的癡呆、伴有皮質(zhì)基底節(jié)變性的癡呆、阿爾茨海 默及血管型混合性癡呆、伴有彌散性路易體疾病的阿爾茨海默障礙、淀粉樣蛋白血管病、大 腦淀粉樣血管病、多發(fā)梗塞性癡呆、唐氏綜合征、與帕金森氏病相關(guān)的癡呆、阿爾茨海默型 癡呆、阿爾茨海默型老年性癡呆、血管性癡呆、歸因于HIV病的癡呆、歸因于頭部創(chuàng)傷的癡 呆、歸因于亨廷頓氏病的癡呆、歸因于皮克氏病的癡呆、歸因于克雅二氏病的癡呆、額顛癡 呆、拳擊員癡呆、與β-淀粉樣蛋白相關(guān)的癡呆、腦和其他器官的淀粉樣變性（年齡和非年 齡相關(guān)）、伴有淀粉樣變性的荷蘭型遺傳性腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷（ΤΒΙ)、顛葉癒痛（TLE)、 缺氧、局部缺血、大腦新陳代謝的破壞、年齡相關(guān)性黃斑變性、2型糖尿病和其他代謝障礙、 肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS)、多發(fā)性硬化癥（Μ巧、動脈血栓形成、自身免疫/炎性疾病、癌 癥如乳腺癌、屯、血管疾病如屯、肌梗塞和中風(fēng)、高血壓、皮肌炎、航病毒?。搜哦喜。?、胃 腸疾病、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、格雷夫斯病、亨廷頓氏病、包涵體肌炎（IBM)、炎癥反應(yīng)、卡 波西氏肉瘤、科斯特曼疾病、紅斑狼瘡、巨隧細(xì)胞肌筋膜炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、肉芽腫性關(guān) 節(jié)炎、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)1 型、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)7型、惠普爾氏病和威爾遜氏病。10. -種用于根據(jù)權(quán)利要求9而使用的化合物，其中該障礙是阿爾茨海默病或2型糖尿 病。11. 一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的化合物或一種如權(quán)利要求6中所定義的 藥物組合物，用于在治療或預(yù)防選自W下各項(xiàng)的疾病或病癥中使用：歸因于阿爾茨海默病 的神經(jīng)認(rèn)知障礙、歸因于創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)認(rèn)知障礙、歸因于路易體疾病的神經(jīng)認(rèn)知障 礙、歸因于帕金森氏病的神經(jīng)認(rèn)知障礙、血管神經(jīng)認(rèn)知障礙W及2型糖尿病。12. -種用于如權(quán)利要求11中所定義而使用的化合物，其中該疾病或病癥是歸因于阿 爾茨海默病的神經(jīng)認(rèn)知障礙或2型糖尿病。13. -種治療或預(yù)防受試者的選自下組的障礙的方法，該組由W下各項(xiàng)組成：阿爾茨 海默?。ˋD)、輕度認(rèn)知損傷（MCI)、記憶損傷、衰老、癡呆、路易體癡呆、伴有漸進(jìn)性核麻搏 的癡呆、伴有皮質(zhì)基底節(jié)變性的癡呆、阿爾茨海默及血管型混合性癡呆、伴有彌散性路易體 疾病的阿爾茨海默障礙、淀粉樣蛋白血管病、大腦淀粉樣血管病、多發(fā)梗塞性癡呆、唐氏綜 合征、與帕金森氏病相關(guān)的癡呆、阿爾茨海默型癡呆、阿爾茨海默型老年性癡呆、血管性癡 呆、歸因于HIV病的癡呆、歸因于頭部創(chuàng)傷的癡呆、歸因于亨廷頓氏病的癡呆、歸因于皮克 氏病的癡呆、歸因于克雅二氏病的癡呆、額顛癡呆、拳擊員癡呆、與β-淀粉樣蛋白相關(guān)的 癡呆、腦和其他器官的淀粉樣變性（年齡和非年齡相關(guān)）、伴有淀粉樣變性的荷蘭型遺傳性 腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷（ΤΒΙ)、顛葉癒痛（TLE)、缺氧、局部缺血、大腦新陳代謝的破壞、年齡 相關(guān)性黃斑變性、2型糖尿病和其他代謝障礙、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS)、多發(fā)性硬化癥 (Μ巧、動脈血栓形成、自身免疫/炎性疾病、癌癥如乳腺癌、屯、血管疾病如屯、肌梗塞和中風(fēng)、 高血壓、皮肌炎、航病毒?。搜哦喜。?、胃腸疾病、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、格雷夫斯病、亨 廷頓氏病、包涵體肌炎（IBM)、炎癥反應(yīng)、卡波西氏肉瘤、科斯特曼疾病、紅斑狼瘡、巨隧細(xì)胞 肌筋膜炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、肉芽腫性關(guān)節(jié)炎、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、干燥綜合征、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)1型、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)7型、惠普爾氏病和威爾 遜氏病，該方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予治療有效量的如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng) 所定義的化合物或如權(quán)利要求6中所定義的藥物組合物。14. 一種治療或預(yù)防選自W下各項(xiàng)的疾病或病癥的方法：歸因于阿爾茨海默病的神經(jīng) 認(rèn)知障礙、歸因于創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)認(rèn)知障礙、歸因于路易體疾病的神經(jīng)認(rèn)知障礙、歸因 于帕金森氏病的神經(jīng)認(rèn)知障礙、血管神經(jīng)認(rèn)知障礙或2型糖尿病，該方法包括向?qū)ζ溆行?要的受試者給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的化合物或治療有效量的 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及作為β-分泌酶抑制劑的新穎的6，7-二氫[1，2，3]三唑并[1，5-a]吡嗪-6-基衍生物，β-分泌酶也稱作β-位點(diǎn)淀粉樣蛋白裂解酶、BACE，特別是BACE1和/或BACE2(其中BACE1也稱作Asp2或膜天冬氨酸蛋白酶2，并且BACE2也稱作Asp1、膜天冬氨酸蛋白酶1或DRAP)。本發(fā)明還涉及包含此類化合物的藥物組合物，涉及制備此類化合物和組合物的方法，并且涉及此類化合物和組合物用于預(yù)防和治療其中涉及β-分泌酶的障礙的用途，這些障礙是如阿爾茨海默病(AD)、輕度認(rèn)知損傷、衰老、癡呆、路易體癡呆、唐氏綜合征、與中風(fēng)相關(guān)的癡呆、與帕金森氏病相關(guān)的癡呆、阿爾茨海默型癡呆、與β-淀粉樣蛋白相關(guān)的癡呆、年齡相關(guān)性黃斑變性、2型糖尿病以及其他代謝障礙。
【IPC分類】A61P25/28, C07D487/04, A61K31/4985
【公開號】CN105324383
【申請?zhí)枴緾N201480033508
【發(fā)明人】D.奧伊里奇, H.J.M.吉森
【申請人】詹森藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月12日
【公告號】CA2911693A1, EP3008065A1, US20160130274, WO2014198854A1