一株高活性克拉維胺酸氨基乙酰化酶的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株高活性克拉維胺酸氨基乙 酷化酶的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引克拉維酸（clavulanicacid)是臨床上常用的0-內(nèi)酷胺酶抑制濟(jì)I，可與阿莫西 林或替卡西林聯(lián)合用藥，從而增強(qiáng)該抗生素對(duì)耐藥菌株的抗菌活性，提高臨床療效，具有重 要的臨床價(jià)值。
[0003] 克拉維酸是由棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)合成的一種次級(jí)代謝產(chǎn) 物，工業(yè)生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵和提取精制。目前發(fā)酵水平是決定克拉維酸生產(chǎn)成本的重 要因素，因此研發(fā)克拉維酸高產(chǎn)菌株具有非常重要的工業(yè)價(jià)值。野生型棒狀鏈霉菌的克拉 維酸產(chǎn)量很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)發(fā)酵的需要，所W現(xiàn)有的棒狀鏈霉菌工業(yè)菌株都是通過(guò) 多輪誘變篩選得到的突變株，但是常規(guī)誘變育種技術(shù)具有隨機(jī)性和盲目性，導(dǎo)致育種工作 效率較低，周期很長(zhǎng)，成為制約發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)提高的一個(gè)瓶頸。開(kāi)發(fā)一種高效的棒狀鏈 霉菌育種方法并獲得高產(chǎn)菌株具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 克拉維胺酸氨基乙酷化酶是從中間體克拉維胺酸轉(zhuǎn)向克拉維酸合成途徑的關(guān)鍵 酶，該酶活性提高時(shí)能夠提高克拉維胺酸轉(zhuǎn)向合成克拉維酸的催化效率，而酶活性降低時(shí) 克拉維胺酸會(huì)流向副產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)克拉維胺酸氨基乙酷化酶進(jìn)行基因改造可W有望獲得克 拉維酸高產(chǎn)菌，但由于基因改造的位點(diǎn)難W選擇，因此，目前尚未有關(guān)于對(duì)克拉維胺酸氨基 乙酷化酶進(jìn)行基因改造而獲得克拉維酸高產(chǎn)菌的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶的 棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用。采用定向進(jìn)化的策略，對(duì)克拉維胺酸氨基乙酷化酶進(jìn)行定向改造，并 配合高通量篩選技術(shù)獲得高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶，進(jìn)而得到克拉維酸高產(chǎn)菌株。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種高活性克拉維酸氨基乙酷化酶，其具有如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
[0008] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及編碼上述高活性克拉維酸氨基乙酷化酶的基因；具體的， 該基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一種棒狀鏈霉菌，其含有上述編碼高活性克拉維酸氨基乙 酷化酶的基因。
[0010] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一株高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶的棒狀鏈霉菌，該菌 株具體為棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavulige;rus)B02-246。已于2015年10月13日保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏編號(hào)為CGMCCNO. 11484。
[0011] 本發(fā)明的棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)B02-246與工業(yè)菌株棒狀鏈 霉菌B02相比，克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因有4個(gè)堿基發(fā)生改變，分別是第1222位由 A變?yōu)镚，第1229位由A變?yōu)門，第1239位由C變?yōu)锳，第1240位由C變?yōu)镚。其中第1222 位堿基突變引起密碼子由AAG變?yōu)镚AG，氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?；?229位堿基突變 引起密碼子由GAC變?yōu)镚TC，氨基酸由天冬氨酸變?yōu)猷l(xiāng)氨酸；第1239位堿基突變引起密碼 子由CTC變?yōu)镃TA，是同義突變，氨基酸沒(méi)有變化，都是亮氨酸；第1240位堿基突變引起密 碼子由CAG變?yōu)镚AG，氨基酸由谷氨酷胺變?yōu)楣劝彼帷?br>[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為棒狀鏈霉菌 (Streptomycesclavuligerus)B02-246。
[0013] 所述棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌劑在制備 克拉維酸中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 進(jìn)一步的，所述棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌 劑在制備0-內(nèi)酷胺酶抑制劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[001引本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)B02-246的制備方法，采用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因，W 已有的克拉維胺酸氨基乙酷化酶缺失菌株為出發(fā)菌，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移技術(shù)建立含有克拉維胺 酸氨基乙酷化酶基因的突變體庫(kù)，篩選獲得正突變株，最后通過(guò)發(fā)酵驗(yàn)證、傳代培養(yǎng)獲得遺 傳性狀穩(wěn)定的棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246。
[0016] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一對(duì)用于體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的 易錯(cuò)PCR的引物，其引物序列分別如序列表中SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。
[0017]上游引物Gcas化rward序列：GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG(SEQIDNO. 3);
[0018]下游引物GcasReverse序列：GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG(SEQIDNO. 4)。
[0019] 所述連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因的具體方法為：
[0020] (1)PCR反應(yīng)體系：模板DNA2ul、PCR緩沖液加1、hqDNA聚合酶Iul、dATP 1~3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化l、25mM MgClzl~8ul、5mMMnClzO~Iul，補(bǔ)加超純水至 50ul。
[0021] 似PCR條件：預(yù)變性97°C10分鐘，變性97°C30秒，退火52~62°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環(huán)35次，終延伸10分鐘。
[0022] 第1次PCR的模板DNA來(lái)源于工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌B02,第2次PCR及后續(xù)PCR的 模板DNA采用上次PCR產(chǎn)物。
[0023] 所述含有克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的突變體庫(kù)的構(gòu)建方法，具體步驟如下：
[0024] (1)將連續(xù)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物用甜al和Ba恤I進(jìn)行雙酶化凝膠瓊脂糖電泳分離后回 收酶切產(chǎn)物，并與同樣雙酶切的穿梭載體PSET152進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)曰，挑取轉(zhuǎn)化 子提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得重組PSET152 ;
[00巧](2)采用接合轉(zhuǎn)移技術(shù)將重組PSET152轉(zhuǎn)入工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌B02的克拉維胺 酸氨基乙酷化酶基因缺失菌株，得到一系列接合子，即構(gòu)建得到克拉維胺酸氨基乙酷化酶 基因的突變體庫(kù)。
[0026] 篩選正突變株所采用的方法為：采用平板透明圈法，對(duì)突變體庫(kù)中的接合子進(jìn)行 高通量篩選。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：
[0028] (1)本發(fā)明首次采用定向突變的方式篩選得到克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的 突變體，通過(guò)連續(xù)易錯(cuò)PCR在體外對(duì)克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因進(jìn)行突變，同時(shí)通過(guò)高 通量篩選方法獲得克拉維酸高產(chǎn)菌株B02-246,克拉維酸合成水平比工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌 B02高1. 3倍，可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0029] (2)本發(fā)明的棒狀鏈霉菌工程菌的制備方法，突變工作的效率高，針對(duì)性非常強(qiáng)， 降低了誘變育種的隨機(jī)性和盲目性，符合工業(yè)生產(chǎn)菌株的育種需要。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是平板透明圈法篩選棒狀鏈霉菌接合子；
[0031] 圖2是B02-246與B02的克拉維酸發(fā)酵水平比較。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[003引實(shí)施例1蟲(chóng)續(xù)易錯(cuò)PCR獲得含突變堿基的目的基因
[0034] 采用連續(xù)易錯(cuò)PCR在體外對(duì)克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因進(jìn)行突變。具體為：
[003引 1.易錯(cuò)PCR的引物為：
[0036]上游引物Gcas化rward序列：GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG;
[0037]下游引物GcasReverse序列：GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG。
[0038] 2.PCR體系：模板DNA化1、PCR緩沖液加1、hqDNA聚合酶lul、dATP1 ~3ul、 dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化IJSmMMgClzl~ 8ul、5mMMnClzO~Iul,補(bǔ)加超純水至 50ul。
[0039] 3.PCR條件：預(yù)變性97°C10分鐘，變性97°C30秒，退火52~62°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環(huán)35次，終延伸10分鐘。
[0040] 第1次PCR模板DNA來(lái)源于工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌B02,第2次PCR及后續(xù)PCR的模 板DNA采用上次PCR產(chǎn)物。
[0041] PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序，結(jié)果顯示：當(dāng)PCR體系中dATPlul、dTTPlul、dGTP化1、 dCTP化1、上游引物化1、下游引物化l、25mMMgCl26ul、5mMMnClzO.加1，PCR退火溫度為 58 °C，2次連續(xù)PCR時(shí)錯(cuò)配堿基數(shù)為4~8，突變頻率比較適合進(jìn)行定向改造。
[0042] 實(shí)施例2:棒狀鏈霉菌克拉維胺酸氨基乙酷化酶突變體庫(kù)的構(gòu)建
[0043] 將實(shí)施例1中的連續(xù)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物用XbaI和BamHI進(jìn)行雙酶切，凝膠瓊脂糖電泳 分離后回收酶切產(chǎn)物，并與同樣雙酶切的穿梭載體pSET152(pSET152為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī) 質(zhì)粒）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a,挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。