具有增強的穩(wěn)定性和增強的保留催化活性的變體重組β-葡萄糖腦苷脂酶蛋白的制作方法
【專利說明】具有増強的穩(wěn)定性和増強的保留催化活性的變體重組 (3-葡萄糖腦昔脂酶蛋白
[0001] 巧關(guān)專利申請
[0002] 本申請是中國專利申請201180064243. 6的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的領(lǐng)域包括用于治療多種溶酶體膽積癥的酶替代療法的蛋白。運些溶酶體 膽積癥包括戈謝病。
【背景技術(shù)】
[0004] 0 -葡萄糖腦巧脂酶是一種可溶性的溶酶體酶，其功能為在管腔膜表面通過與銷 脂酶激活蛋白C和陰離子憐脂的相互作用來水解糖脂葡糖神經(jīng)酷胺。0-葡萄糖腦巧脂酶 在組織巨隧細(xì)胞從被吞隧的受損細(xì)胞和病原體中分解和回收膜的過程中特別重要。由于葡 糖神經(jīng)酷胺是超過300種參與多種重要的細(xì)胞途徑和信號級聯(lián)的糖脂和神經(jīng)節(jié)巧脂的主 要前體分子，因而其是維持運些多種脂質(zhì)分子復(fù)雜的平衡所必需的。 陽0化]戈謝病由0-葡萄糖腦巧脂酶的缺乏引起，該缺乏造成葡糖神經(jīng)酷胺的蓄積。戈 謝病通過多種臨床癥狀體現(xiàn)，包括貧血、血小板減少、肝脾腫大和骨骼崎形?；谏窠?jīng)受累 情況將戈謝病分為S種類型：1型（非神經(jīng)型）；2型（急性神經(jīng)型）；和3型（慢性神經(jīng) 型）。目前尚無已知的治療戈謝病的方法，但是已批準(zhǔn)使用補充缺乏的P-葡萄糖腦巧脂酶 的酶替代療法巧RT)和抑制葡糖神經(jīng)酷胺的合成底物減少療法來治療該病。還將其他治療 方法如小分子藥理伴侶和蛋白折疊調(diào)節(jié)劑作為運種疾病的潛在療法進(jìn)行評估。在運些治療 方法中，ERT是針對戈謝病的內(nèi)臟癥狀最成熟和有效的臨床療法。伊米巧酶（重組0-葡 萄糖腦巧脂酶；Cerezyme?，GenzymeCo巧.?)開發(fā)出來并被抑A于1994年批準(zhǔn)用于治療戈 謝病，而且是目前治療運種疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。 陽006] 盡管普遍認(rèn)為Cerezyme?ERT是最有效的治療方法，但是運種溶酶體酶在中性抑 和37°C下不穩(wěn)定。事實上，藥物的絕大部分在靜脈輸注至血液后不久就被不可逆性的滅活。 僅有少部分保持催化活性并進(jìn)入祀巨隧細(xì)胞，其賦予了全部的治療效果。因此，開發(fā)一種更 為穩(wěn)定的P-葡萄糖腦巧脂酶是有益的，該酶在從蛋白生產(chǎn)步驟到在進(jìn)入所需的人類對象 后所遇到的生理條件下均不易于被酶滅活。
[0007] 發(fā)巧概沐
[0008] 本發(fā)明提供了變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，其特征在于與野生型重組 0 -葡萄糖腦巧脂酶相比，具有增強的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了變體重組0 -葡萄糖腦巧脂 酶蛋白，其特征在于與野生型重組P-葡萄糖腦巧脂酶相比，保留了更高的催化活性。本發(fā) 明進(jìn)一步描述了變體重組P-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，其在一個或多個下述位置可W具有氨 基酸變異：316、317、321 和 145。
[0009] 本發(fā)明描述了一種變體重組0 -葡萄糖腦巧脂酶蛋白的制備方法，其特征在于與 野生型重組0-葡萄糖腦巧脂酶相比，保留了更高的催化活性。本發(fā)明進(jìn)一步描述了一種 組合物，所述組合物包括變體重組e-葡萄糖腦巧脂酶蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā) 明還提供了一種組合物，所述組合物包括變體重組0 -葡萄糖腦巧脂酶蛋白和藥學(xué)上可接 受的緩沖劑。
[0010] 本發(fā)明描述了變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的環(huán)1 區(qū)域具有一個或多個替換氨基酸，所述一個或多個替換氨基酸的特征在于具有側(cè)鏈構(gòu)象， 所述側(cè)鏈構(gòu)象增加所述蛋白活性位點附近的有序性。本發(fā)明進(jìn)一步描述了一種變體重組 0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的活性位點（a6)附近的a-螺旋中具有一 個或多個替換氨基酸，所述一個或多個替換氨基酸側(cè)鏈的特征在于具有側(cè)鏈構(gòu)象，所述側(cè) 鏈構(gòu)象穩(wěn)定所述螺旋并牽拉鄰近的環(huán)1使其遠(yuǎn)離催化位點且具有開放和活化的構(gòu)象。本發(fā) 明還提供了一種變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，所述蛋白在0-折疊（02)和a-螺 旋（a2)之間的無規(guī)則卷曲區(qū)域具有一個或多個替換氨基酸，所述一個或多個替換氨基酸 的特征在于具有側(cè)鏈構(gòu)象，所述側(cè)鏈構(gòu)象有利于不同殘基和二級結(jié)構(gòu)之間更好的相互作用 W改善穩(wěn)定性。
[0011] 本發(fā)明提供了一種通過向所需對象給予變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白來治 療溶酶體膽積癥的方法，所述蛋白的特征在于與野生型重組0-葡萄糖腦巧脂酶相比具有 增強的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了一種通過向所需對象給予變體重組P-葡萄糖腦巧脂酶蛋 白來治療溶酶體膽積癥的方法，所述蛋白的特征在于與野生型重組P-葡萄糖腦巧脂酶相 比保留了更高的催化活性。本發(fā)明還提供了一種通過向所需對象給予變體重組0-葡萄糖 腦巧脂酶蛋白來治療溶酶體膽積癥的方法，所述蛋白的特征在于與野生型重組0-葡萄糖 腦巧脂酶相比具有增強的特異性活性。本發(fā)明還提供了一種通過向所需對象給予變體重組 0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白來治療溶酶體膽積癥的方法，所述蛋白的特征在于在下述一個或 多個位置具有氨基酸變異：316、317、321和145。本發(fā)明還提供了一種通過向所需對象給予 變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白來治療戈謝病的方法。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種化合物，所述化合物包括變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋 白，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一個：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、SEQIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈Q IDNO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或 沈QIDNO:16。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種變體重組e-葡萄糖腦巧脂酶蛋白，其特征在于與野生型重 組0-葡萄糖腦巧脂酶相比能夠增加表達(dá)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種制備包含變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白的化合物的方 法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一個：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、沈QIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈Q IDNO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或沈Q IDN0:16。本發(fā)明還提供了一種制備編碼變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白的核酸的方 法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一個：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、沈QIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈QID NO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或沈Q IDNO:16。 引附圖概沐
[0016] 根據(jù)對本發(fā)明的下述詳細(xì)描述并結(jié)合附圖考慮時，本發(fā)明的前述和其他方面是清 楚的。出于解釋本發(fā)明的目的，在附圖中所示的均為優(yōu)選的實施方式，但是將理解的是本發(fā) 明不限于所公開的特定方式。附圖并不一定是按照比例尺繪制的。在附圖中：
[0017] 圖I(A)顯示了酶活性的巧U量值，用于比較變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白和 野生型酶在典型瞬時轉(zhuǎn)染實驗48小時后分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中的相對表達(dá)情況；度）顯示 了western印跡分析，用于比較在瞬時轉(zhuǎn)染后變體重組0 -葡萄糖腦巧脂酶蛋白和野生型 GlcCerase蛋白的相對分泌量。
[0018] 圖2顯示了在抑7. 5和37°C下H14化修飾、H145F修飾、F316A/L317F修飾、K321N 修飾、K321A修飾、F316A/L317F/K321N修飾、和H14化/K321N修飾的變體重組0 -葡萄糖腦 巧脂酶蛋白與野生型重組P-葡萄糖腦巧脂酶蛋白相比的穩(wěn)定性；和
[0019] 圖3顯示了在P冊和37°C下具有F316A/L317F修飾的變體重組0-葡萄糖腦巧脂 酶蛋白與野生型重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白相比的穩(wěn)定性。
[0020] 發(fā)巧詳沐
[0021] 通過參考下述的詳細(xì)描述結(jié)合作為本公開一部分的附圖和實施例可能更容易理 解本主題。應(yīng)理解的是本發(fā)明不限于本發(fā)明所描述和/或所示的特定設(shè)備、方法、應(yīng)用、條 件或參數(shù)，并且本發(fā)明所使用的術(shù)語僅用于通過示例性的方式描述特定實施方式的目的而 非旨在限制所要求保護的發(fā)明。
[0022] 此外，除非上下文中另有明示，否則在說明書中包括所附權(quán)利要求書中使用的單 數(shù)形式的"一"和"一"W及"所述"包括復(fù)數(shù)，提到一個特定數(shù)值至少包括該特定值。本發(fā) 明所使用的術(shù)語"多個"指一個W上。當(dāng)表示數(shù)值范圍時，另一個實施方式包括從一個特定 值和/或至其它特定值。類似地，當(dāng)通過在其前面使用"約"表示近似值時，應(yīng)理解為特定 值形成另一個實施方式。所有范圍均是開放式和可組合的。
[0023] 提供實施例W幫助進(jìn)一步理解本發(fā)明。所使用的特定材料、方案和條件旨在進(jìn)一 步解釋本發(fā)明，不應(yīng)將其解釋為限制其合理的范圍。
[0024] 除非另有說明，否則對變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白性質(zhì)的說明是相對 于野生型重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白的性質(zhì)（SEQIDN0:1)而言的。在本發(fā)明中， "GlcCerase"是0-葡萄糖腦巧脂酶的縮寫。所有的氨基酸編號均是相對于SEQ.ID.no. 1 而言的。因此，位置145將是SE化ID.NO. 1中的第145個的氨基酸。而且，本發(fā)明所公開的 變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白還包括其功能性片段或衍生物。
[002引在本發(fā)明中，"約中性抑"指包括通常被認(rèn)為是生理抑的抑（即，在37°C下抑約 7. 5)
[00%] 適宜的變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白的特征可W在于，與野生型重組0-葡 萄糖腦巧脂酶蛋白相比，在細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白生產(chǎn)期間，具有相似或增加的蛋白表達(dá)和向細(xì) 胞培養(yǎng)基中的分泌。適宜的變體重組P-葡萄糖腦巧脂酶蛋白的特征可W在于，與野生型 重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白相比具有增強的穩(wěn)定性。運些蛋白在生理條件下具有增強的 穩(wěn)定性并且那些生理條件可W是體內(nèi)的。此外，運些蛋白的特征還可W在于在約中性抑和 約37°C的條件下具有增強的穩(wěn)定性。該增強的穩(wěn)定性可W在約中性抑和約37°C的條件下 監(jiān)測約3小時的一段時間。所述增強的穩(wěn)定性在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)保持，并且可W在細(xì)胞內(nèi)保 持。運些蛋白還可W在溶酶體內(nèi)具有增強的穩(wěn)定性，并且在溶酶體內(nèi)的條件可W是約抑5 和約37°C。運些蛋白還可W具有增強的穩(wěn)定性，其特征在于蛋白水解降解作用減少，減少的 蛋白水解降解作用可W發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。此外，減少的蛋白水解降解作用可W在細(xì)胞的溶酶 體內(nèi)。運些蛋白還可W在非生理條件下具有增強的穩(wěn)定性，如在蛋白純化過程中的緩沖溶 液中。在蛋白純化過程中運些緩沖溶液可W具有高于約7的抑或低于約3的抑。運些緩 沖溶液還可W含有有機溶劑或離液鹽。運些蛋白還可W在溫度范圍為約2°C至約37°C的緩 沖溶液中具有增強的穩(wěn)定性。此外，運些蛋白還可W在溫度范圍為約2°C至約8°C的緩沖溶 液中具有增強的穩(wěn)定性。而且，運些蛋白可W在溫度約20°C的緩沖溶液中具有增強的穩(wěn)定 性。運些蛋白還可W在凍融循環(huán)后或凍干后復(fù)溶時具有增強的穩(wěn)定性。運些蛋白還可W在 藥物制劑緩沖液如鹽水中具有增強的穩(wěn)定性。
[0027] 適宜的變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白可W是其特征在于與野生型重組0-葡 萄糖腦巧脂酶蛋白相比保留了更高的催化活性。運些蛋白在生理條件下保留了更高的催化 活性，并且更高的保留的催化活性可W是在體內(nèi)。此外，運些蛋白還可W是其特征在于在約 中性抑和約37°C的條件下保留了更高的催化活性。該更高的保留的催化活性可W在約中 性抑和約37°C的條件下監(jiān)測約2小時的一段時間。運些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)基中保留了更高 的催化活性并且更高的保留的催化活性可W是在細(xì)胞內(nèi)。此外，運些蛋白可W在溶酶體內(nèi) 保留了更高的催化活性并且在溶酶體內(nèi)的條件可W是約P冊和約37°C。運些蛋白還可W 保留了更高的催化活性，其特征在于蛋白水解降解作用減少，該減少的蛋白水解降解作用 可W發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。此外，該減少的蛋白降解可W在細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。運些蛋白還可W在 非生理條件下保留更高的催化活性，如在蛋白純化過程中的緩沖溶液中。在蛋白純化過程 中運些緩沖溶液可W具有高于約7的抑或低于約3的抑。運些緩沖溶液還可W含有有機 溶劑或離液鹽。運些蛋白還可W在約2°C至約37°C的溫度范圍內(nèi)保留更高的催化活性。此 夕F，運些蛋白還可W在約2°C至約8°C的溫度范圍內(nèi)保留更高的催化活性。而且，運些蛋白 還可W在約20°C的溫度保留更高的催化活性。運些蛋白還可W在凍融循環(huán)后或凍干后復(fù) 溶時保留更高的催化活性。運些蛋白還可W在藥物制劑緩沖液如鹽水中保留更高的催化活 性。
[0028] 變體重組0-葡萄糖腦巧脂酶蛋白還可W在一個或多個下述位置具有氨基酸變 異：316、317、321和145。運些蛋白還可W具有氨基酸變異或多個氨基酸變異：（1)F316A和 L317F;或似K321N;或（3)H14化；或（4)H145F; (5)F316A、L317F、和K321N;或化)K321A; 或（7)K321V; (8)F316A、L317F、和K321A;或（9)F316A、L317F、和K321V;或（10)H145L F316A、和L317F;或（Il)HH化和K321N;或（12)H14化和K321A;或（13)H14化和K321V。 運些蛋白中的某些還可W是其特征在于與野生型重組P-葡萄糖腦巧脂酶蛋白相比，在細(xì) 胞培養(yǎng)和蛋白生產(chǎn)期間具有相