I a Ip)家族的一種或多種或所有成員構(gòu)成的 血液制品，每個(gè)成員都由任選地連接至一條或多條重鏈（例如，重鏈Hl、Η2、Η3和/或Η4) 的輕鏈（亦稱二庫寧肽）構(gòu)成。Ia Ip家族的示例性成員包括：間-α抑制劑（IaI)，其由 連接至2條重多肽鏈（例如，兩條Η1、兩條Η2或Hl和Η2)的二庫寧肽構(gòu)成，并且具有約225 至約260kDA的分子量；以及前α抑制劑（Ρ α I)，其由連接到單條重鏈（例如，Η1、Η2、Η3或 Η4)的二庫寧肽構(gòu)成，并且具有約110至約130kDA的分子量。I a Ip可以是單獨(dú)的二庫寧 肽和/或二庫寧肽與一條或多條重鏈的組合。"I a Ip家族"意指I a Ip家族的所有成員。 "血液制品材料"意指任何血液衍生的組合物，其至少包括I α Ιρ，和I a Ip家族：IgG重量 比等于約1 : 30、等于約1 : 5或介于約1 : 30與約1 : 5之間（如約1 : 30、1 : 25、 1:20、1:15、1:10或1:5)的186，以及因子￥111:1€111)家族重量比等于或小于 約1 : 106(如約 1 : 106、1 : 107、1 : 10s、l : IO9或 I : 101°)的因子 VIII 和馮維勒布 蘭德因子：1〇1?家族重量比等于或小于約1:40(如約1:40、1:50、1:60、1:70、 1 : 80、1 : 90、1 : 100或1 : 200)的馮維勒布蘭德因子中的一者。血液制品材料可以是例 如全血漿、冷凝蛋白貧乏的血漿、液態(tài)血漿、解凍的新鮮冰凍血漿（FFP)、解凍的FFP24、解 凍的冰凍血漿（FP)、解凍的FP24、源血漿、回收的血漿、經(jīng)溶劑/洗滌劑處理的血漿（SDP)、 富血小板血漿（PRP)、貧血小板血漿（PPP)、血清、血液或其稀釋或濃縮制劑。
[0018] "支持體"意指以取決于血液制品的特性的方式與至少一種血液制品相互作用的 任何裝置，這樣使得該裝置可用于將存在于混合物或溶液中的血液制品分級(jí)。支持體可以 是柱、膜、盤、芯片或用于層析術(shù)或親和捕獲的其他裝置，其實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的。
[0019] "被基本上保留"意指存在于起始材料中的物質(zhì)的至少約20%，如約20%、30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的量被捕獲在支持體上。
[0020] "耗乏"意指減少物質(zhì)的濃度或量。如果物質(zhì)的濃度或量被減少約20 %至約100 %， 如約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，則可以將其認(rèn)為被耗乏。
[0021] "I a Ip耗乏的血液制品材料"意指來源于以下血液制品材料的任何材料，該血液 制品材料耗乏一種或多種或所有I a Ip家族成員并且進(jìn)一步包括IgG。更確切地說，I a Ip 耗乏的血液制品材料包括一種或多種或所有I a Ip家族成員的總量的不多于約80%，如 約 80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、Ι%、0· 1%、0· 01%或 0%，以及存在于起 始血液制品材料中的總IgG的至少約20%、如約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或100%。I a Ip耗之的血液制品材料還可以包括一種或多種另外的血液制品。
[0022] "分離的"意指已經(jīng)從起始材料中分離約20%至100% (如約20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或100% )的血液制品。起始材料可以是血液制品材料、I a Ip 耗乏的血液制品材料或已經(jīng)被進(jìn)一步耗乏一種或多種非I a Ip血液制品的I a Ip耗乏的血 液制品材料。
[0023] "純度"意指已經(jīng)被分離的血液制品（如通過本發(fā)明的方法分離的血液制品）不合 其他組分的程度。將純度表示為分離的血液制品組合物中的血液制品的重量百分比。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[0025] 圖1是一個(gè)層析譜，示出了在整體DEAE柱（CIMMULTUS?)上進(jìn)行的冷凝蛋白貧乏 的血漿分離。將冷凝蛋白貧乏的血漿稀釋于20mM Tris緩沖液+200mM NaCUpH 7. 6)中， 并加載到8mL DEAE柱上。加載后，將未結(jié)合的蛋白收集為流過級(jí)分（F/T)。然后，將該柱 用290mM NaCl(W#l)和IOOmM乙酸鹽緩沖液（pH 2. 95) (W#2)洗滌。然后，用包含750mM NaCl (EL)的緩沖液洗脫間-α抑制劑蛋白。可以將F/T和洗滌級(jí)分進(jìn)一步處理，以分離其 他有價(jià)值的治療性血漿蛋白。
[0026] 圖2是通過在整體DEAE柱上分離冷凝蛋白貧乏的血漿而產(chǎn)生的級(jí)分的SDS-PAGE 分析。將冷凝蛋白貧乏的血漿稀釋于20mM Tris緩沖液+200mM NaCUpH 7.6)中，并加載 到 8mL DEAE柱上。加載后，將未結(jié)合的蛋白收集為流過級(jí)分（F/T)。然后，將該柱用290mM NaCl (W#l)和IOOmM乙酸鹽緩沖液（pH 2. 95) (W#2)洗滌。最后，用包含750mM NaCl (EL)的 緩沖液洗脫間-α抑制劑蛋白?？梢詫/T和洗滌級(jí)分進(jìn)一步處理，以分離其他有價(jià)值的 治療性血漿蛋白。
[0027] 詳細(xì)說明
[0028] 血液制品材料可以包含許多血液制品，其中的一些或所有制品的分尚可以具有醫(yī) 療或經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明是針對(duì)一種從單個(gè)起始樣品中順序地分離多種血液組分的方法。更 確切地說，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是針對(duì)從I a Ip耗乏的血液制品材料中分離一種或多種血液制品 的方法。
[0029] Ia Ip家族是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的血漿關(guān)聯(lián)的絲氨酸蛋白酶抑制劑。此家族的成員 是由通過糖胺多糖共價(jià)連接的重和輕多肽亞基構(gòu)成。輕鏈（亦稱二庫寧肽）負(fù)責(zé)間-a蛋 白的絲氨酸蛋白酶抑制活性。名稱"二庫寧肽"反映存在兩個(gè)庫尼茨（Kunitz)類型的蛋白 酶抑制結(jié)構(gòu)域。間-a蛋白的重鏈（H1、H2、H3、H4)亦稱透明質(zhì)酸（HA)結(jié)合蛋白。在正常 血漿中，二庫寧肽被發(fā)現(xiàn)主要處于復(fù)合物形式，作為間- a抑制劑（I a I)，其具有約225至 約260kDa的分子量，以及前a抑制劑（P a I)，其具有約110至約130kDa的分子量）。在 Ια I中，二庫寧肽連接至2條重多肽鏈（例如，Hl和H2)上，而在Pa I中，僅有單條重鏈 (例如，H3)連接至二庫寧肽上。
[0030] 可以通過使用一種支持體產(chǎn)生I a Ip耗乏的血液制品材料，該支持體用于從血液 制品材料中分離I a Ip (例如，一種或多種（例如，兩種、三種、四種或更多種，或所有）I a Ip 家族成員，如Ia I、Pa I和/或二庫寧肽，或Ia I和Pa I兩者）。在本發(fā)明中，可以通過本 領(lǐng)域已知的任何可應(yīng)用的方法從血液制品材料中分離I a Ip，包括層析方法，如陰離子交換 層析、陽離子交換層析、親和層析或染料-配體層析。用于分離I a Ip的示例性方法可以發(fā) 現(xiàn)于US 20110190194中，其描述了使用DEAE層析與低pH緩沖液，具體是pH小于4.0(例 如，pH 4. 0、3. 7、3. 5、3. 4、3. 3、3. 1、2. 9、2. 0)，以分離I a Ip。該方法可以包括多于一個(gè)緩 沖步驟，其中隨后的緩沖液可以具有低于第一次的pH。該緩沖液可以是乙酸、乙酸鈉、檸檬 酸、甘氨酸、磷酸鹽或鹽緩沖液。例如，該第一緩沖液可以是鹽濃度物為290mM NaCl的鹽緩 沖液并且該第二緩沖液可以具有約2. 9的pH。將US 20110190194通過引用結(jié)合在此?？?替代地，US 20120053113描述了使用肝素親和層析分離I α Ip。分離I a Ip的另外的方法 在本領(lǐng)域是已知的。該I a Ip耗乏的血液制品材料可以包括來自能夠捕獲I a Ip的支持 體（如層析柱）的流過物。如果向此支持體施加洗滌液，則該洗滌液可以被任選地包括在 該I a Ip耗乏的血液制品材料中，或可替代地，它自身可以是一種I a Ip耗乏的血液制品材 料。
[0031] 在本發(fā)明的一些方法中，在被施加至支持體上之前，可以將血液制品材料與上樣 緩沖液混合。本發(fā)明的上樣緩沖液可以是允許或增強(qiáng)一種或多種血液制品在支持體上保留 的緩沖液。或可替代地，本發(fā)明的上樣緩沖液還可以減少支持體上污染物的保留。上樣緩 沖液可以是具有約10至約300mM鹽的鹽緩沖液，如具有約10、20、30、40、50、100、120、140、 160、180、200、220、240、260、280 或 300mM 鹽的鹽緩沖液。
[0032] 在具體實(shí)施例中，該支持體是QA支持體并且該上樣緩沖液包括約10至IOOmM鹽， 如 10、20、30、40、50、60、75、80、85、90、95 或 IOOmM 鹽。在一些情況下，pH 是從 5. 5 至 6. 5， 如5. 5、5. 7、5. 9、6. 0、6. 1、6. 3或6. 5。在某些實(shí)施例中，該支持體是QA支持體，該上樣緩沖 液包括約50mM鹽，并且pH是約6. 0。
[0033] 在具體實(shí)施例中，該支持體是DEAE支持體并且該上樣緩沖液包括約150至250mM 鹽，如 150、175、200、225 或 250mM 鹽。在一些情況下，pH 是從 L 0 至 8. 0,如 L 0、7· 2、7· 4、 7. 6、7. 8或8. 0。在某些實(shí)施例中，該支持體是DEAE支持體，該上樣緩沖液包括約200mM鹽， 并且pH是約7. 6。
[0034] 施加與鹽緩沖液混合的血液制品材料可以允許或增強(qiáng)I a Ip的保留，同時(shí)減少污 染物的保留。上樣緩沖液的其他實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的。
[0035] 該I a Ip耗乏的血液制品材料可以具有I a Ip家族：IgG重量比小于約 1:30(如約1:40、1:50、1:100、1:200 或 1:300)，以及因子￥111:1〇1?家族 重量比大于約1 : 1〇6(如約1 : 1〇5、1 : 1〇4、1 : 1〇3、1 : IO2或1 : 10)的因子Vin和 馮維勒布蘭德因子：1〇1?家族重量比大于約1:40(如1:30、1:20、1:10、1:5 或1 : 1)的馮維勒布蘭德因子中的一者。
[0036] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及從I a Ip耗乏的血液制品材料中分離一種或多種血液制品所 需或通過從I a Ip耗乏的血液制品材料中分離一種或多種血液制品得到的組合物。
[0037] 血液制品
[0038] 本發(fā)明的血液制品包括1€(11)、白蛋白、18厶、186、181、18〇、186、1￥18、抗0 186、乙 型肝炎IgG、麻疹I(lǐng)gG、狂犬病IgG、破傷風(fēng)IgG、水痘帶狀皰疹I(lǐng)gG、纖維蛋白原（因子I)、凝 血酶原（因子Π )、因子III、因子V、VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因 子XIII、纖連蛋白、α -1抗胰蛋白酶、α -2抗纖溶酶、尿激酶、抗凝血酶m、Cl-抑制劑、蛋 白C、蛋白S、蛋白Ζ、蛋白Z相關(guān)的蛋白酶抑制劑、纖溶酶原、組織纖溶酶原激活劑、纖溶酶原 激活劑抑制劑-1、纖溶酶原激活劑抑制劑_2、馮維勒布蘭德因子、因子Η、前激肽釋放酶、高 分子量激肽原、肝素捕因子II以及凝血酶。
[0039] 間- α抑制劑蛋白（I a Ip)家族是一組血漿相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制劑。此家族 的成員是由通過糖胺多糖共價(jià)連接的重鏈和輕鏈（二庫寧肽）多肽亞基構(gòu)成。在這些重和 輕鏈形式中，二庫寧肽仍是無活性的，直到通過部分蛋白水解降解將其釋放，這是一種作為 調(diào)節(jié)活性的手段的機(jī)制。Ia Ip可以抑制炎癥中涉及的絲氨酸蛋白酶，例如，彈性蛋白酶、纖 溶酶和組織蛋白酶G。Ia Ip可以有用于治療某些疾病和障礙，例如，膿毒癥、膿毒性休克、 內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血以及纖維增生。
[0040] 白蛋白是血漿的主要蛋白。白蛋白的基本生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)血液的膠態(tài)滲透壓。 白蛋白能夠與水、陽離子、脂肪酸、激素、膽紅素、甲狀腺素以及其他化合物相互作用。白蛋 白可以用于治療患有失血、休克、嚴(yán)重?zé)齻蚱渌t(yī)學(xué)病癥的患者。它還可以用作細(xì)胞生長(zhǎng) 培養(yǎng)基的組分或用作藥理活性化合物的賦形劑。
[0041] 免疫球蛋白或抗體是在血液中循環(huán)并執(zhí)行各種功能的內(nèi)源性蛋白。它們對(duì)于免疫 功能而言是關(guān)鍵的。免疫球蛋白由四條多肽鏈（兩條輕鏈和兩條重鏈）構(gòu)成。免疫球蛋白 類型由重鏈決定，并且包括IgM、IgD、IgG、IgE以及IgA?？梢酝ㄟ^其具體組成或功能進(jìn)一 步定義免疫球蛋白。
[0042] 凝血因子是通過指導(dǎo)凝血過程而控制出血的血液蛋白。循環(huán)性凝血因子是無活 性的，但是損傷啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)。凝血過程涉及在損傷部位附近的血管的收縮，隨后積聚血 小板。血小板釋放導(dǎo)致形成血小板栓的化學(xué)信號(hào)。在血小板表面上，凝血因子形成纖維蛋 白凝塊。凝血因子包括因子I (纖維蛋白原）、II (凝血酶原）、III (組織因子）、IV(鈣）、 V(不穩(wěn)定因子）、VII (穩(wěn)定因子）、VIII (抗血友病因子A)、IX(抗血友病因子B)、X(斯圖 亞特（Stuart Prower)因子）、XI (抗血友病因子C)、XII (哈格曼（Hageman)因子）以及 XIII (纖維蛋白穩(wěn)定因子）。
[0043] 纖維蛋白原是在鈣離子存在下由凝血酶轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的血漿糖蛋