擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。采用Bi曲ye? Terminator v3. 1(購自Life公司，貨號(hào)4336919) 對(duì)檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，Sanger測(cè)序的操作步驟如下： A)DNA測(cè)序模板處理，加入ExoSAP-口酶，在ABI9700PCR儀中，按W下程序進(jìn)行處理： 37 °C，15min；80 °C，15min;4°C，infinite。
[0028] B)參考Bi曲ye?Terminatorv3.I切cleSequencingKit操作說明制備測(cè)序 PCR體系。
[0029] C)在ABI9700PCR儀中，按W下程序進(jìn)行處理： 96°C, 1min-（96°C, 10S- 50°C, 5S- 60°C, 4min) , 25 個(gè)循環(huán)一 4°C保溫 D)用酒精/EDTA/NaAc法對(duì)測(cè)序PCR的產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0030] 巧室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入IOyL化-Di化rmamide溶解DM,溶解后的樣品需要在 95°C變性4min,迅速置冰中冷卻4min后，上樣電泳。
[0031] 測(cè)序結(jié)果(僅顯示部分）如圖4至圖7所示，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與參考序列相符。
[0032] 實(shí)施例四檢測(cè)IMH和ID肥基因突變的方法的準(zhǔn)確性 本檢測(cè)準(zhǔn)確性定義為不同引物檢測(cè)結(jié)果的一致性。 陽03引本檢測(cè)方法使用表1中的檢測(cè)引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，此外，使用表 4中的驗(yàn)證引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。22例樣品經(jīng)兩套不同引 物檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致，表明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性為100%。
[0034]

注：NMD即未檢測(cè)到突變。
[0035] 實(shí)施例五檢測(cè)IMH和IDH2基因突變的方法的特異性和靈敏度 本檢測(cè)的檢測(cè)特異性定義為陰性符合率，檢測(cè)靈敏度定義為陽性符合率。
[0036] 本檢測(cè)方法使用表1中的檢測(cè)引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，此外，使用表 4中的驗(yàn)證引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。檢測(cè)引物和驗(yàn)證引物檢 測(cè)結(jié)果為陰性（未檢測(cè)到突變）的樣品完全一致，本檢測(cè)方法的檢測(cè)特異性為100%。
[0037] 檢測(cè)引物和驗(yàn)證引物檢測(cè)結(jié)果為陽性（檢測(cè)到突變）的樣品完全一致，突變位點(diǎn) 及類型也完全一致，結(jié)果如表6所示，本檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度為100%。
[0038]
實(shí)施例六檢測(cè)IDm和IDH2基因突變的方法的檢測(cè)下限 本檢測(cè)方法采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，本檢測(cè)方法的最低檢測(cè)下限化OD)為20%，當(dāng) 突變細(xì)胞與正常細(xì)胞的比值低于40%時(shí)，不排除假陰性的可能。
[0039] DNA輸入量的檢測(cè)結(jié)果如表8所示，在DNA量輸入范圍12. 5~20化g/reaction間， 可保證突變樣品檢測(cè)結(jié)果一致。 W40] 實(shí)施例屯檢測(cè)IMH和ID肥基因突變的方法的精密度 本檢測(cè)方法的精密度定義為對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)得到同一結(jié)果的能力。
[0041] 本檢測(cè)方法對(duì)7例樣品進(jìn)行了I畑1和I畑2基因外顯子4的S次重復(fù)檢測(cè)。同一 樣品不同批次的擴(kuò)增均成功，Sanger測(cè)序結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示，同一樣品不同批次 的檢測(cè)結(jié)果一致，本檢測(cè)方法批間精密度為100%。
[0042]
注：NMD即未檢測(cè)到突變。 陽0創(chuàng)本檢測(cè)方法對(duì)1例陽性樣本（IDHlR132H)和1例陰性樣本（IDHlNMD)進(jìn)行了IDHl基因外顯子4的3復(fù)孔檢巧U。同一樣品不同孔間的擴(kuò)增均成功，Sanger測(cè)序結(jié)果如表 8所示。結(jié)果顯示，同一樣品不同孔間的檢測(cè)結(jié)果一致，本檢測(cè)方法的批內(nèi)精密度為100%。
注：NMD即未檢測(cè)到突變。
[0044] 因此，本發(fā)明所提供的引物和檢測(cè)方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的檢測(cè)方法， 解決了IDHl和IDH2基因外顯子4突變的檢測(cè)問題，可W為甲橫酸伊馬替尼的臨床用藥提 供指導(dǎo)，利于CN-AML患者的預(yù)后指導(dǎo)，減少不良反應(yīng)，在幫助指導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面 具有重要意義。
[0045] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的引物，其特征在于：包括針對(duì)IDHl基因外顯子4 的上游引物 TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCTTCGCTITCTGCAT 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACC TGCAAAATCACATTAITGCCAAC，以及針對(duì) IDH2 基因外顯子 4 的上游引物 TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGGCTGTGTTGTTGCTTG 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACCCTGCCATCTTTTGGGGTGAAG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的引物，其特征在于：所述引物 中，IDHl基因外顯子4的上游引物、IDHl基因外顯子4的下游引物、IDH2基因外顯子4的 上游引物和IDH2基因外顯子4的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1。3. -種檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的方法，其特征在于：包括如下步驟：A)提取DNA樣 品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析 后，采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的方法，其特征在于：所述步驟 A) 中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的方法，其特征在于：所述步驟 B) 中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1:98°C 3min;階段2:98°C IOs;階段3:63°C 30s;階 段4:72°(：11^11;階段5:返回到階段2,34個(gè)循環(huán)；階段6 :721€51^11;階段7:25°(：保溫。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的方法，其特征在于：所述步驟 C) 中，采用Sequencher 4. 1. 4軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)IDHl和IDH2基因突變的引物在制備檢測(cè)IDHl和 IDH2基因突變?cè)噭┲械挠猛尽?br>【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)IDH1和IDH2基因突變的引物，其特征在于：包括針對(duì)IDH1基因外顯子4的上游引物和下游引物，以及針對(duì)IDH2基因外顯子4的上游引物和下游引物。本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的引物可以實(shí)現(xiàn)IDH1和IDH2外顯子4突變的特異性檢測(cè)，引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105154547
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510568734
【發(fā)明人】梁耀銘, 于世輝, 趙薇薇, 燕啟江, 胡昌明
【申請(qǐng)人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月9日