一組用于肺癌分子分型的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及癌癥診斷和分子生物學(xué)領(lǐng)域，W及診斷技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。具體地， 本發(fā)明設(shè)及一組用于肺癌分子分型的基因，通過肺癌分子分型方法的建立和通過檢測肺癌 組織中的特異性基因的表達(dá)，鑒別肺癌最主要的亞型：肺腺癌和肺鱗癌。本發(fā)明還設(shè)及完成 所述肺癌分子分型方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是世界范圍內(nèi)對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。男性肺癌發(fā)病率 和死亡率均占惡性腫瘤的第一化女性肺癌發(fā)病率占惡性腫瘤的第二化僅次于乳腺癌，死 亡率占第一位。根據(jù)《2012腫瘤登記年報(bào)》，全國腫瘤登記地區(qū)肺癌的發(fā)病率為53. 57/10 萬，中國人口標(biāo)化率為25. 34/10萬，男性為女性的1. 94倍；肺癌的死亡率為45. 57/10萬， 男性為女性的2. 05倍。
[0003] 肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。其中，非小細(xì)胞肺癌占80 %W上，主要由 腺癌（又稱肺腺癌）和鱗癌（又稱鱗狀細(xì)胞癌或肺鱗癌）組成。在目前臨床實(shí)際工作中， 組織病理學(xué)檢查是肺癌診斷和分類的金標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)的病理組織學(xué)方法是將獲取的病變組織 通過固定、脫蠟、染色等步驟，制成切片在顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。檢測方法步驟繁多， 等待時(shí)間較長，檢測結(jié)果具有一定的主觀性。特別是當(dāng)腫瘤分化較差，缺少肺腺癌和肺鱗癌 的形態(tài)學(xué)特征，分型就比較困難。因此出現(xiàn)了組織學(xué)類型不明確型非小細(xì)胞肺癌運(yùn)一概念。 2009年一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在活檢樣本中，組織學(xué)類型不明確型非小細(xì)胞肺癌占25 %，在細(xì)胞學(xué) 標(biāo)本中占40%。因此，需要一種比較客觀的能夠有效區(qū)分肺腺癌和肺鱗癌的方法。
[0004] 另外，肺癌是一類分子水平上高度異質(zhì)性的疾病，組織學(xué)形態(tài)相同的腫瘤，其分子 遺傳學(xué)改變不盡一致，從而導(dǎo)致了肺癌治療反應(yīng)和預(yù)后的差別。越來越多的新的放化療藥 物和祀向藥物的出現(xiàn)要求嚴(yán)格區(qū)分肺腺癌和肺鱗癌。如肺腺癌使用培美曲塞后生存期顯著 增長，肺鱗癌患者使用貝伐單抗存在大出血的風(fēng)險(xiǎn)，白蛋白紫杉醇聯(lián)合順銷治療晚期肺鱗 癌療效較好，因此對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)分型是肺癌個(gè)體化治療的必然要求。
[0005] 近年來，腫瘤標(biāo)志物的研究大大加深了對(duì)肺癌的認(rèn)識(shí)，使得對(duì)其進(jìn)一步分類、 診斷及預(yù)后判斷成為可能。如癌胚抗原（CEA)用于肺腺癌的檢測，細(xì)胞角蛋白19片段 21-1 (CYFR21-1)用于肺鱗癌的檢測，神經(jīng)特異性締醇化酶（NS巧用于小細(xì)胞肺腺癌的診 斷等，但是因?yàn)槊舾行院吞禺愋缘膯栴}，存在較高的假陽性和假陰性，診斷效率低?；蚍?子診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、背景機(jī)理明確的優(yōu)點(diǎn)，近年來被越來越多地運(yùn)用于各種腫 瘤。因此，利用基因分子診斷，找到一種區(qū)分肺腺癌和肺鱗癌的方法，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)性化用 藥，對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療具有重要的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一組用于肺癌分子分型的基因，建立肺癌統(tǒng) 計(jì)分析模型，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一組用于肺癌分子分型的基因的用途。
[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之=是提供一種用于肺癌分子分型的試劑盒及其用途。
[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供一組用于肺癌分子分型的基因在制備用于 判斷肺癌亞型的基因忍片中的應(yīng)用。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 在本發(fā)明的一方面，提供一組用于肺癌分子分型的基因，包括如下13個(gè)基因： COMP基因、FXYD3 基因、GABRP基因、HLA-DQA1 基因、MMP10 基因、NMU基因、NTS基因、RPS4Y1 基因、沈RPINB4基因、沈RPINB5基因、SPRR2A基因、SPRR3基因、UPKIB基因。
[0012] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，該組用于腫瘤分子分型的基因，還包括如下17個(gè) 基因（即包括30個(gè)基因）：化CA2基因、DSG3基因、FGB基因、HSD17B2基因、KRT14基因、 KRT17基因、KRT5基因、KRT6A基因、KRT她基因、MIR205HG基因、MMP12基因、S100A2基因、 沈RPINB3 基因、SPINKl基因、SPRRlB基因、TFPI2 基因、TRIM29 基因。
[0013] 本發(fā)明通過基因檢測、標(biāo)志物組合及數(shù)據(jù)挖掘算法的聯(lián)合應(yīng)用來建立基因標(biāo)志物 組合模型，利用多基因預(yù)測模型區(qū)分肺癌的最主要亞型，即肺腺癌和肺鱗癌，主要包括W下 步驟：
[0014] (1)收集肺癌的臨床診斷數(shù)據(jù)和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建包含人類已知2萬多個(gè)基 因、2000例樣品的肺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫；
[0015] (2)對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出30個(gè)與肺癌亞型密切相關(guān)的基因，分 別為：化CA2基因、COMP基因、DSG3基因、FGB基因、FXYD3基因、GABRP基因、HLA-DQAl基 因、HSD17B2 基因、KRT14 基因、KRT17 基因、KRT5 基因、KRT6A基因、KRT她基因、MIR205HG 基因、MMPlO基因、MMP12基因、NMU基因、NTS基因、RPS4Y1基因、S100A2基因、SERPINB3基 因、沈RPINB4基因、沈RPINB5基因、SPINKl基因、SPRRlB基因、SPRR2A基因、SPRR3基因、 TFPI2 基因、TRIM29 基因、UPKlB基因。
[0016] (3)計(jì)算上述30個(gè)基因表達(dá)模式，通過統(tǒng)計(jì)分析模型對(duì)肺癌亞型進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算 生物學(xué)樣品與肺癌亞型的相似度分?jǐn)?shù)（SimilarityScore)。根據(jù)相似度分?jǐn)?shù)最高的判定規(guī) 貝1J，判定亞型。
[0017] 本發(fā)明提供了一種用于判斷肺癌亞型的檢測方法，包括W下步驟：
[0018] (1)將取自肺癌患者的生物學(xué)樣品與生物標(biāo)志物接觸，所述生物標(biāo)志物包括上述 30個(gè)基因；所述生物學(xué)樣品是取自所述對(duì)象的離體腫瘤組織，可W是新鮮樣本或者福爾馬 林固定的石蠟包埋（FFP巧樣本；
[0019] 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行肺癌亞型判斷：
[0020] (2)檢測該生物學(xué)樣品中30個(gè)基因的表達(dá)模式和表達(dá)水平，基于30個(gè)基因的表 達(dá)水平來判斷該生物學(xué)樣品的亞型類別。采用數(shù)據(jù)分析方法，計(jì)算該生物學(xué)樣品與肺癌亞 型的相似度分?jǐn)?shù)（SimilarityScore)。根據(jù)相似度分?jǐn)?shù)最高的判定規(guī)則，判定亞型。所 述檢測包括從所述樣品制備RNA，所述RNA用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)，可選實(shí)時(shí)RT-PCR或者基因忍片或者高通量測序技術(shù)。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供一組用于判斷肺癌亞型的基因在制備用于判斷肺癌亞 型的試劑盒中的應(yīng)用。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于判斷肺癌亞型的試劑盒，該試劑盒包含如下 生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物選自上述一組用于肺癌分子分型的基因中的任意一種或多 種。
[0023] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述生物標(biāo)志物是核酸、寡核酸鏈、或PCR引物組。
[0024] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述PCR引物組包括：
[002引 COMP基因：正向引物如沈Q ID NO. 1所示，反向引物如沈Q ID NO. 2所示；
[0026] FXYD3基因：正向引物如沈Q ID NO. 3所示，反向引物如沈Q ID NO. 4所示；
[0027] GABRP基因：正向引物如沈Q ID NO. 5所示，反向引物如沈Q ID NO. 6所示；
[002引 HLA-DQAl基因：正向引物如沈Q ID NO. 7所示，反向引物如沈Q ID NO. 8所示；
[002引 MMPlO基因：正向引物如沈Q ID NO. 9所示，反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[0030] NMU基因：正向引物如SEQ ID NO. 11所示，反向引物如SEQ ID NO. 12所示；
[0031] NTS基因：正向引物如沈Q ID NO. 13所示，反向引物如沈Q ID NO. 14所示；
[0032] RPS4Y1基因：正向引物如沈Q ID NO. 15所示，反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[003引沈RPINB4基因：正向引物如沈Q ID NO. 17所示，反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[0034] 沈RPINB5基因：正向引物如沈Q ID NO. 19所示，反向引物如沈Q ID NO. 20所示；
[0035] SPRR2A基因：正向引物如沈Q ID NO. 21所示，反向引物如沈Q ID NO. 22所示；
[0036] SPRR3基因：正向引物如沈Q ID NO. 23所示，反向引物如沈Q ID NO. 24所示；
[0037] UPKlB基因：正向引物如沈Q ID NO. 25所示，反向引物如沈Q ID NO. 26所示。
[0038] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述PCR引物組還包括：
[0039] 化CA2基因：正向引物如沈Q ID NO. 27所示，反向引物如沈Q ID NO. 28所示；
[0040] DSG3基因：正向引物如沈Q ID NO. 29所示，反向引物如沈Q ID NO. 30所示；
[0041]FGB基因：正向引物如沈Q ID NO. 31所示，反向引物如沈Q ID NO. 32所示；
[004引HSD17B2基因：正向引物如沈Q ID NO. 33所示，反向引物如沈Q ID NO. 34所示；
[0043]KRT14基因：正向引物如沈Q ID NO. 35所示，反向引物如沈Q ID NO. 36所示；
[0044] KRT17基因：正向引物如沈Q ID NO. 37所示，反向引物如沈Q ID NO. 38所示；
[004引 KRT5基因：正向引物如SEQ ID NO. 39所示，反向引物如SEQ ID NO. 40所示；
[0046]KRT6A基因：正向引物如沈Q ID NO. 41所示，反向引物如沈Q ID NO. 42所示；
[0047]KRT她基因：正向引物如沈Q ID NO. 43所示，反向引物如沈Q ID NO. 44所示；
[0048]MIR205HG基因：正向引物如沈Q ID NO. 45所示，反向引物如沈Q ID NO. 46所示；
[0049]MMP12基因：正向引物如沈Q ID NO. 47所示，反向引物如沈Q ID NO. 48所示；