食管癌中hsa-mir-612的檢測引物組及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[OOOU 本發(fā)明設及基因檢測技術領域，具體設及人類hsa-mir-612基因擴增的檢測引物 組及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 食管癌是常見的一種消化道惡性腫瘤，在世界惡性腫瘤中居第6位，全世界每年 約有30萬人死于食管癌。我國是世界上食管癌高發(fā)國家之一，每年平均病死約15萬人。根 據1990-1992年中國惡性腫瘤死因回顧調查結果，我國食管癌的死亡率為17. 38/10萬，占 癌癥死亡率的16. 05%，位于惡性腫瘤死亡率的第四位。食管癌的發(fā)病率隨著年齡增長而升 高，W50~70歲年齡段最為高發(fā)，大部分患者的確診年齡超過60歲。近年來，雖然對食管 癌的治療取得了一些進展，但鑒于其早期癥狀的隱蔽性和非特異性，臨床上得到診治的多 數已經是中、晚期患者。早期食管癌與中、晚期食管癌的預后有著很大的差別，早期食管癌 綜合治療5年生存率高達90% -100%，而中晚期患者5年生存率低于10%。隨著研究的深 入，食管癌的早期診斷有了較大的發(fā)展。最近的大量研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(mirNA)表達水平 的改變與食管癌的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療和預后密切相關。
[0003]miRNA是一類廣泛存在于真核生物中，由大約22個核巧酸組成的非編碼小分子RNA，Ma1:ure-mirNA在RNA-InducedSilencingComplex(RISC)的引導下同mRNA的特異序 列結合，從而導致mRNA降解或翻譯抑制；研究表明miRNA在生物體的生長發(fā)育及分化過程 中起有重要的調控意義，在不同的發(fā)育時期及不同組織中mirNA也有不同的表達模式。據 報道，超過50%的miRNA編碼基因位于與腫瘤或在復制過程中不穩(wěn)定的脆性位點相關的基 因區(qū)間，提示miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。據報道，hsa-mir-612與食管癌的發(fā)生、 發(fā)展具有密切關系。在轉移性食管癌中hsa-mir-612的表達量明顯上調，可能是食管癌發(fā) 生淋己結轉移調控中的關鍵分子，是食管癌早期診斷及轉移相關的分子標志物。有望成為 臨床食管癌轉移有效的診斷及干預分子祀點。
[0004] 可用于分析小分子RNA檢測方法主要有微陣列、Nodhern Blot等基于分子雜交 的方法，W及實時巧光定量PCR技術。基于分子雜交的方法敏感度低、耗時長、RNA的用量 較大；實時巧光定量PCR技術是在PCR反應體系中添加巧光物質或含巧光基團的探針，利用 巧光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR的過程，W達到對未知樣品中檢測因子的定性或定量分 析的目的。 陽〇化]但目前還沒用于食管癌轉移特征性的miRNA檢測試劑盒。
[0006] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明提供一種檢測食管癌中hsa-mir-612基因的引物組；
[0008] 本發(fā)明提供一種檢測食管癌中hsa-mir-612的試劑盒；
[0009] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用技術方案的基本構思是：檢測hsa-mir-612基 因擴增的引物組，包括hsa-mir-612基因特異性引物組、內參U6基因特異性引物組；
[0010] 所述hsa-mi;r-612基因特異性引物組包括：
[0011] 上游引物hsa-mir-612-F，如沈QIDNO: 1所示的核巧酸序列， 陽〇1引下游引物hsa-mir-612-R，如沈QIDN0:2所示的核巧酸序列；
[0013] 所述內參U6基因特異性引物組包括：
[0014] 上游引物U6-F，如沈QIDN0:3所示的核巧酸序列， 陽01引下游引物U6-R，如SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列。
[0016] 本發(fā)明中，定義"hsa-mi;r-612基因特異性引物"是指WmirBase中基因序列 (Accession:MI0003625)為模板，本發(fā)明所述的hsa-mi;r-612基因特異性引物，經優(yōu)化設計 能有效的避免pre-miRNA、pri-miRNA或其它小分子RNA的污染；
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述沈QIDNO:USEQIDNO: 2、SEQIDNO: 3和沈QID N0:4具有至多5個核巧酸差異的序列。
[0018] 本領域技術人員公知，引物上少數核巧酸殘基的變化，尤其是引物在5'端出現(xiàn)的 少數核巧酸的改變，只能造成該核巧酸的錯配，但不會造成整個DNA復制合成過程無法進 行，進而不會引起聚合酶鏈式反應產物產量的明顯波動，因此，由上述SEQIDNO:USEQID N0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有至多5個核巧酸差異的序列也可W得到正確的足夠 的聚合酶鏈式反應巧光信號，因此所述序列也應該包括在本發(fā)明中。
[0019] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，對所述hsa-mir-612基因特異性引物組、內參U6基因特 異性引物組進行硫化、甲基化、形成膚核酸、在核糖的2'位置引入甲基和/或氣取代基。
[0020] 檢測hsa-mi;r-612基因擴增的試劑盒，包括W上所述的檢測hsa-mi;r-612基因擴 增的引物組。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括陰性質控品和陽性質控品，所述陰性 質控品為&0,所述陽性質控品為體外合成的hsa-mi;r-612基因。
[0022] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括Premix,所述Premix包含DNA聚合酶、 SYBRGreenI、dNTPs及PCR反應緩沖液。
[002引作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述試劑盒分為陰性質控品、陽性質控品、hsa-mir-612 反應體系、內參U6反應體系；
[0024]所述hsa-mi;r-612 反應體系包括Premix10JiL濃度為 10JiM的hsa-mi;r-612-F0. 5JiL濃度為10JiM的hsa-mi;r-612-R0. 5JiL最后用無菌超純水將反應體系補至 18.OyL; 陽0巧]所述內參U6反應體系包括Premix10yL濃度為10yM的U6-F0. 5yL濃度為 10yM的U6-R0. 5yL最后用無菌超純水將反應體系補至18. 0yL。
[00%] 所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0027] 1)提取樣本的核酸DNA ;
[0028] 2)取待檢樣本進行巧光定量PCR擴增反應；
[0029]扣根據擴增曲線Ct值，判斷樣品屬性。
[0030] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟2)中巧光定量PCR擴增反應的程序為95。IOmin; 95°C，15sec;60°C，lmin。
[0031] 采用上述技術方案后，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有W下有益效果：本發(fā)明通過設 計特異性擴增引物，對反應體系進行優(yōu)化，實現(xiàn)各個成分在反應體系內的最佳濃度配比，最 大程度的實現(xiàn)了巧光聚合酶鏈式反應技術的高靈敏性，高特異性等特點，操作簡捷，單個反 應從樣品處理只需1. 5-2小時，適合大規(guī)模樣本的處理，同時結果穩(wěn)定，重復性好。
【附圖說明】 陽0巧圖1是hsa-hsa-mir-612基因檢測試劑盒靈敏度測試圖； 陽〇3引圖2是hsa-hsa-mi;r-612基因檢測試劑盒靈敏度測試圖；
【具體實施方式】
[0034] W下結合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進一步解釋說明，本發(fā)明所采用的試劑均 為市售。 陽0對 實施例1:
[0036] 用本發(fā)明所述的試劑盒檢測食管癌中hsa-hsa-mi;r-612
[0037] 1)引物的設計：針對hsa-mir-612和U6基因序列設計特異性引物。序列分別如 下：
[0038] hsa-mir-ei2特異性引物：
[0039] hsa-mir-612-F :5'GCTGGGCAGGGCTTCT3,（沈Q ID N0:1)
[0040] hsa-