一種檢測(cè)c-kit基因突變的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測(cè)c-kit基因突變的引物與方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 原癌基因c-kit基因位于人類染色體4qll-12,編碼145邸的跨膜蛋白CD117,屬 于第III類酪氨酸激酶受體家族。c-kit基因的突變可能會(huì)造成不依賴配體的酪氨酸激酶持 續(xù)激活，從而引起下游信號(hào)通路的素亂，進(jìn)而引發(fā)疾病。
[0003] 急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukemia,AML)W骨髓與外周血中原始和幼稚 髓性細(xì)胞異常增生為主要特征，目前尚無(wú)確切的病因，但可能與環(huán)境因素、電離福射、化學(xué) 接觸W及與機(jī)體對(duì)某些病毒感染所致的特殊反應(yīng)有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性髓系白血病患者中， 有約8%的患者發(fā)生了c-kit基因的突變，在核屯、結(jié)合因子相關(guān)性急性髓系白血?。╟ore bindingfactor-AML，CBF-AML)患者中，c-kit基因外顯子8和17突變的發(fā)生率較高，c-kit 基因外顯子8和17主要突變形式是外顯子8的插入缺失突變和外顯子17的點(diǎn)突變。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)200910201796. 6公開(kāi)了檢測(cè)c-kit基因突變的引物，該引物針對(duì)胃 腸道腫瘤中c-kit基因外顯子9和11，通過(guò)外顯子9和11突變位點(diǎn)的組合檢測(cè)，指導(dǎo)腫瘤 患者對(duì)甲橫酸伊馬替尼類藥物的治療。
[0005] 中國(guó)專利申請(qǐng)201410606037. 9公開(kāi)了檢測(cè)c-kit基因突變的引物和探針，該引物 和探針針對(duì)c-kit基因外顯子9、11、13和17中的至少一種突變類型，采用巧光PCR進(jìn)行擴(kuò) 增，對(duì)產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序分析，該引物和探針不能覆蓋c-kit基因外顯子9、11、13和17 的所有突變，而且該方法的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。
[0006] 通過(guò)對(duì)c-kit基因外顯子8和17突變的檢測(cè)，有助于甲橫酸伊馬替尼應(yīng)用的預(yù) 后，在幫助指導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)c-kit基因突變的新引物與 方法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了c-kit基因外顯子8和17突變的準(zhǔn) 確檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)的位點(diǎn)包括c-kit基因外顯子8 (c-kit-X8)和c-kit基因外顯子17 (c-kit-X17)〇
[000引本發(fā)明提供一種檢測(cè)c-kit基因突變的引物，包括針對(duì)c-kit基因外顯子8的上 游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAGATTCTGCCCTTTGAACTTG(SEQIDNO. 1)和下游引物CAGGA AACAGCTATGACCTGAAATTCAAGTGAATTGCAGTCC(沈QIDNO. 2)，W及針對(duì)c-kit基因外顯子 17 的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTTTTCTTTTCTCCTCCAA(SEQIDNO. 3)和下游引物CAGG AAACAGCTATGACCTGCAGGACTGTCAAGCAGAG(SEQIDNO. 4)0
[000引優(yōu)選地，所述引物中，外顯子8的上游引物、外顯子8的下游引物、外顯子17的上 游引物和外顯子17的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1。
[0010] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)c-kit基因突變的方法，包括如下步驟:A)提取 DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電 泳分析后，采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 :98°CSmin;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,30個(gè)循環(huán)；階段6:721： Smin;階段7 :25 °C保溫。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟C)中，采用Sequencher4. 1. 4軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0014] 此外，本發(fā)明還提供檢測(cè)c-kit基因突變的引物在制備檢測(cè)c-kit基因突變?cè)噭?中的用途。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)c-kit基因外顯 子8和17突變的新引物，該引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明還提 供了一種檢測(cè)c-kit基因突變的方法，通過(guò)使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度高、 準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，可W為甲橫酸伊馬替尼的臨床用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1本發(fā)明提供的c-kit基因外顯子8引物的擴(kuò)增片段。
[0017] 圖2本發(fā)明提供的c-kit基因外顯子17引物的擴(kuò)增片段。
[001引圖3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0019] 圖4c-kit基因外顯子8野生型的部分測(cè)序圖。
[0020] 圖5c-kit基因外顯子8突變型的部分測(cè)序圖。
[0021] 圖6c-kit基因外顯子17野生型的部分測(cè)序圖。
[002引圖7c-kit基因外顯子17突變型的部分測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)c-kit基因外顯子8和c-kit基因外顯子17,設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反 應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好的引物。
[0025] 表1本發(fā)明提供的引物
實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting，c-kit基因外顯子8擴(kuò)增片段位 于C虹4:55589610-55589931間，長(zhǎng)度為322bp;c-kit基因外顯子17擴(kuò)增片段位于 C虹4:55599207-55599391間，長(zhǎng)度為18化P。無(wú)其它同源基因，結(jié)果如圖1至圖2所示，與 c-kit基因參考序列相符。
[002引使用表1中的引物、表2中的PCR擴(kuò)增體系和表3的PCR擴(kuò)增條件對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn) 行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性高， 無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。
[0027] 實(shí)施例Sc-kit基因突變的檢測(cè) 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購(gòu)自Tiagen,貨號(hào)：DP318)的說(shuō)明書，將DNA樣品稀釋至l(K)ng/iiL備用。
[002引 PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動(dòng)超保真2XMasterMix(購(gòu)自肥B公司，貨號(hào)：M049化）， PCR擴(kuò)增體系如表2所示，PCR擴(kuò)增條件如表3所示。外顯子8的上游引物、外顯子8的下 游引物、外顯子17的上游引物和外顯子17的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1，外顯子8的上游 引物濃度、外顯子8的下游引物濃度、外顯子17的上游引物濃度和外顯子17的下游引物濃 度都為lOp/mol。
[0029]
對(duì)