一種檢測idh1和idh2基因突變的引物與方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領域，尤其設及一種檢測IMll和ID肥基因突變的引物 與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異巧樣酸脫氨酶1( (IDHl)和異巧樣酸脫氨酶2 (ID肥）分別位于染色體2q33. 3和 15q26. 1，IDHl和ID肥借助NADP作為輔助因子，催化異巧樣酸的氧化脫簇反應生成a-酬 戊二酸，參與細胞內(nèi)氧化損傷的防御。
[0003] 現(xiàn)有研究表明，I畑1和ID肥基因突變存在于急性髓系白血?。ˋML)、急性淋己 白血?。ˋLL)及骨髓增殖性疾?。∕PD)患者中。在AML患者中，IDH1、IDH2基因突變的發(fā) 生頻率分別為 6. 6-9. 6%、3. 0-10. 4% ;在核型正常的AML(切togeneticallynormalacute myeloidIe址emia,CN-AML)中，IDHUID肥基因突變的發(fā)生頻率分別為10~16%、10~19〇/〇。 IMll和ID肥基因突變主要為外顯子4上的點突變，常見的突變有IMllR132C/R132G/ R132S/R132H/R132L/R132P，ID肥R140G/R140W/R140L/R140Q和ID肥R172K/R172M/R172S。 IDHl和/或IDH2基因突變的CN-AML患者具有較低的完全緩解率（CR)、較高的客觀有效率 (RR)和較短的總生存期（OS),因此，IDHl和/或ID肥基因突變一般代表較差的預后。
[0004] 中國專利申請201310365905. 4公開了檢測肥基因突變的核巧酸序列，包 括ARMS突變特異性引物、化qman探針和核酸擴增阻滯引物。該專利申請通過核酸擴增阻 滯引物和ARMS突變特異性引物相結(jié)合，通過巧光PCR實現(xiàn)了IDH1/ID肥基因突變的檢測， 但存在反應體系復雜，需要多種引物和光定量PCR儀的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測IDHl和IDH2基因突變的引 物與方法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，實現(xiàn)了檢測IDHl和ID肥基因外顯子4 突變的準確檢測。本發(fā)明檢測的位點包括IDHl基因外顯子4和ID肥基因外顯子4。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測IMll和ID肥基因突變的引物，其特征在于：包括針對IMll 基因外顯子 4 的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCTTCGCTTTCTGCAT(沈QIDNO. 1)和下 游引物CAGGAAACAGCTATGACCTGCMAATCACATTATTGCCAAC(SEQIDNO. 2)，W及針對ID肥基因 外顯子 4 的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGGCTGTGTTGTTGCTTG(沈QIDNO. 3)和下游引 物CAGGAAACAGCTATGACCCTGCCATCTTTTGGGGTGAAG(SEQIDNO. 4)。
[0007] 優(yōu)選地，所述引物中，I畑1基因外顯子4的上游引物、I畑1基因外顯子4的下游引 物、ID肥基因外顯子4的上游引物和ID肥基因外顯子4的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1。
[0008] 相應地，本發(fā)明還提供一種檢測IMll和ID肥基因突變的方法，包括如下步驟：A) 提取DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產(chǎn)物進行凝 膠電泳分析后，采用Sanger測序法檢測，對檢測結(jié)果進行分析。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的PCR擴增反應條件包括：階段I:98°C3min;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,34個循環(huán)；階段6:721： Smin;階段7 :25 °C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟C)中，采用Sequencher4. 1. 4軟件對檢測結(jié)果進行分析。
[0012] 此外，本發(fā)明還提供檢測I畑1和IDH2基因突變的引物在制備檢測I畑1和IDH2 基因突變試劑中的用途。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測I的11和ID肥基因 夕F顯子4突變的引物，該引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。此外，本發(fā)明還提供 了一種檢測IDHl和ID肥基因突變的方法，通過使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度 高、準確性好等優(yōu)點，可W為甲橫酸伊馬替尼的臨床用藥提供指導。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發(fā)明提供的IMll基因外顯子4引物的擴增片段。
[0015] 圖2本發(fā)明提供的ID肥基因外顯子4引物的擴增片段。
[0016] 圖3PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0017] 圖4I畑1基因外顯子4野生型的部分測序圖。 陽01引圖5I畑1基因外顯子4突變型的部分測序圖。
[0019] 圖6ID肥基因外顯子4野生型的部分測序圖。
[0020] 圖7ID肥基因外顯子4突變型的部分測序圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。 陽0巧實施例一引物 發(fā)明人針對IDHl和IDH2基因外顯子4,設計了大量引物，通過引物反應條件的優(yōu)化和 比較，篩選出了特異性好的引物。
[0023]
實施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進行Blasting,IDHl基因外顯子4引物擴增片段位 于C虹2:209113061-209113491間，長度為43化P;ID肥基因外顯子4引物對擴增片段位于 C虹15:90631664-90632063間，長度為4(K)bp;。無其它同源基因，結(jié)果如圖1至圖2所示， 與IMll和IDH2基因參考序列相符。
[0024] 使用表1中的引物、表2中的PCR擴增體系和表3的PCR擴增條件對檢測樣品進 行擴增，對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產(chǎn)生。
[0025] 實施例SI畑巧日I畑2基因突變的檢測 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購自Tiagen,貨號：DP318)的說明書，將DNA樣品稀釋至l(K)ng/iiL備用。
[0026] PCR擴增采用Q5?熱啟動超保真2X Master Mix(購自肥B公司，貨號：M049化）， PCR擴增體系如表2所示，PCR擴增條件如表3所示。I畑1基因外顯子4的上游引物、I畑1 基因外顯子4的下游引物、ID肥基因外顯子4的上游引物和ID肥基因外顯子4的下游引 物濃度比為1 :1 :1 :1，I的11基因外顯子4的上游引物濃度、ID化基因外顯子4的下游引物 濃度、I畑2基因外顯子4的上游引物濃度和I畑2基因外顯子4的下游引物濃度都為IOp/ mol O
[0027]
對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物的特異性高， 無非特異性