c-PA的獲得：與實施例1方法相同。
[0214] 2)重組昆蟲桿狀病毒的制備：與實施例1方法基本相同，不同的是將 pFastBac-PB2-37替換為pFastBac-PB2-103,得到P3代表達(dá)PB2-103的重組昆蟲桿狀病 毒、P3代表達(dá)PBl的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒。
[0215] 3)、流感病毒RNA聚合酶的表達(dá)
[0216] 按照實施例1的方法，將上述2)得到P3代表達(dá)PB2-103的重組昆蟲桿狀病毒、P3 代表達(dá)PBl的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為 108pfu/mL)混合后轉(zhuǎn)入細(xì)胞High Five，裂解，得到含有PB2-103截短體流感病毒RNA聚合 酶的上清液。
[0217] 2、流感病毒RNA聚合酶的鎳親和層析純化
[0218] 將上述1得到的含有PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液按照上述實施 例1的方法進(jìn)行鎳柱親和層析純化，得到純化的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0219] 將上述純化的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE檢測。
[0220] 結(jié)果如圖5所示，1-103為純化的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶，可以看出， 得到分子量約為80KD的PBl亞基條帶、稍小于80KD的PA條帶以及IlKD PB2的103個氨 基酸殘基條帶，表明，得到PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0221] 分別回收每個亞基的條帶，送去進(jìn)行蛋白N端測序，驗證得確得到H5N1流感病毒 RNA聚合酶的三個亞基，表明電泳檢測的目的大小的條帶得確為H5N1流感病毒RNA聚合酶 的三個亞基。
[0222] 計算含量，每升培養(yǎng)液可獲得5mg的純化RNA聚合酶（PA-PB1-PB2-103)。
[0223] 二、流感病毒RNA聚合酶的大規(guī)模表達(dá)、純化
[0224] 1、流感病毒RNA聚合酶大規(guī)模表達(dá)
[0225] 按照實施例1的方法將P3代表達(dá)PB2-103的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PBl的 重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為108pfu/mL)混 合后按1% (體積/體積）加入High Five細(xì)胞、培養(yǎng)、裂解，收集上清液，得到含有PB2-103 截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液。
[0226] 2、流感病毒RNA聚合酶的純化
[0227] A :親和層析
[0228] 按照實施例1的方法將上述1得到的含有PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶的 上清液進(jìn)行鎳柱親和層析，用2倍-5倍Beads體積洗脫目的蛋白，收集洗脫液，得親和層析 純化PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0229] 電泳檢測，與圖5的1-103大小一致。表明，得到PB2-103截短體流感病毒RNA聚 合酶。
[0230] B、離子交換層析
[0231 ] 按照實施例1的方法將上述A純化后的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶進(jìn)行 離子交換層析，用200mM至400mM鹽濃度線性梯度洗脫樣品，結(jié)果與圖4B -致，收集200mM 至400mM洗脫得到的洗脫液（對應(yīng)的主峰）為離子交換層析純化后PB2-103截短體流感病 毒RNA聚合酶。
[0232] 電泳檢測，結(jié)果圖5的1-103大小一致，說明得到目的蛋白。
[0233] C、凝膠層析
[0234] 按照實施例1的方法將實施例1的方法將上述B純化后的PB2-103截短體流感病 毒RNA聚合酶的上清液進(jìn)行凝膠層析，結(jié)果與圖3 -致。
[0235] 電泳檢測，結(jié)果圖5的1-103大小一致，說明得到目的蛋白。
[0236] 三、流感病毒RNA聚合酶與流感病毒的核酸promoter雙鏈RNA結(jié)合
[0237] 1、promoter核酸（RNA)的獲得：與實施例1相同。
[0238] 2、流感病毒RNA聚合酶與promoter雙鏈RNA結(jié)合
[0239] 與實施例1基本相同，不同的是替換為純化PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶， 得到結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter的 PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0240] 將結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶和未結(jié)合RNA的 PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶凝膠層析純化。
[0241] 結(jié)果與圖4C 一致所示，收集280nM下53毫升處出峰對應(yīng)的洗脫液，為結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶（四體形式，分子量為720KD);收集280nM 下68毫升出峰對應(yīng)的洗脫液，為PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶（二體形式，分子量 為360KD)，收集280nM下58毫升出峰對應(yīng)的洗脫液，為PB2-103截短體流感病毒RNA聚合 酶（單體形式，分子量為180KD);表明PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶主要以二體（未 加 RNA啟動子時）和四體（加入RNA啟動子后）形式存在，而不是PB2-37截短體流感病毒 RNA聚合酶的單體存在形式。
[0242] 結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter 的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)果無顯著差異。
[0243] 四、流感病毒RNA聚合酶的結(jié)晶
[0244] 采用商購的結(jié)晶試劑盒（hampton reaserch company)，將上述濃縮后結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter的PB2-103截短 體流感病毒RNA聚合酶，均在結(jié)晶緩沖液條件為30% PEG20000、100mMTrisHCL(pH8. 5)、 500mMNaCL以及20°C溫度環(huán)境下結(jié)晶。
[0245] 結(jié)合vRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶圖如圖7E所示， 結(jié)合cRNA promoter的PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶圖如圖7F所示，可以看出， 均獲得類似于長方形外觀的流感病毒RNA聚合酶晶體。
[0246] 為了確定此為目的蛋白結(jié)晶是否為流感病毒RNA聚合酶晶體，取出晶體后，使用 沉淀劑反復(fù)洗滌，除去粘在晶體上的蛋白溶液，洗凈的晶體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果 與圖5的1-103 -致，說明該晶體為PB2-103截短體流感病毒RNA聚合酶晶體。
【主權(quán)項】
1. 一種流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體表達(dá)、純化及結(jié)晶的方法，為先將流感病毒RNA聚合 酶的PBl亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在離體的昆蟲細(xì)胞 中共表達(dá)、純化，得到RNA聚合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結(jié)合形成復(fù)合體，再將所述復(fù) 合體結(jié)晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體； 所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N = 37-280 中的任一自然數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N = 37-130 中的任一自然數(shù)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于： 所述PB2亞基截短體為如下1)或2)或3): 1) 為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前37位的氨基酸殘基形成的蛋白； 2) 為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前130位的氨基酸殘基形成的蛋白； 3) 為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前103位的氨基酸殘基形成的蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述昆蟲細(xì)胞為High Five細(xì)胞； 所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為H5N1、H1N1或H3N2。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述將流感病毒RNA聚合酶的PBl亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體 的編碼基因在昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，所述Bac-to-Bac桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的供體質(zhì)粒為pFastBac，大腸桿菌為DHlOBac，昆蟲細(xì)胞為Sf9。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述PBl亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示； 所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示； 所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示； 1) 所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-37位； 2) 所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-130位； 3) 所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-103位。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述PBl亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示； 所述PA亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6所示； 1) 所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5'末端 第1-111位； 2) 所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5'末端 第1-390位； 3) 所示的所述PA亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5'末端第 1-309 位。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述純化為將共表達(dá)得到的所述RNA聚合酶依次經(jīng)親和層析、離子交換層析和凝膠層 析，得到純化后的RNA聚合酶； 所述結(jié)晶采用的緩沖液由終濃度為2 % -30 %的PEG1000-20000、終濃度為 50mM-500mMNaCL和濃度為100mM、pH值為8. 5的TrisHCL緩沖液組成； 所述結(jié)晶采用的溫度為4°C -20°C。9. 由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備的RNA聚合酶晶體。10. 權(quán)利要求9所述的RNA聚合酶晶體在抗流感病毒藥物篩選或疫苗設(shè)計和制備中的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法。本發(fā)明提供的流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法，為先將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)，得到RNA聚合酶，再進(jìn)行純化、結(jié)晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用了不同長度的截短保留氨基端的PB2蛋白片段與其它兩個亞基全長蛋白進(jìn)行共表達(dá)純化及復(fù)合體組裝，這一截短后的小復(fù)合體可以在多種截短情況下、使用不同毒株獲得晶體。本方法不僅為流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，同時，對抗流感病毒藥物篩選、廣譜性疫苗和藥物的設(shè)計研發(fā)進(jìn)程也將具有重要意義。
【IPC分類】C12N15/866, C12N15/54, C12N9/12
【公開號】CN105018441
【申請?zhí)枴緾N201410162712
【發(fā)明人】劉迎芳
【申請人】中國科學(xué)院生物物理研究所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年4月22日