u/mL)混合后按1% (體積/體積）加入，27°C 培養(yǎng)60小時，使用離心機在4°C、離心力4000g下離心10分鐘收集細胞。
[0106] 在培養(yǎng)過程中，開啟波式反應器的給氧系統(tǒng)給培養(yǎng)袋不斷補充氧氣。如使用錐形 瓶或其它類型細胞培養(yǎng)瓶則只需保持通氣即可，不需要特別補氧方式。
[0107] 將上述收集細胞按照1:10(質量：體積）溶解于裂解緩沖液中，超聲破碎方法 破碎細胞，使用超聲破碎細胞是在〇°C冰液中保溫放置裝有細胞懸液的容器，在30w功率 /50mL細胞溶液比率下，按照超聲3秒停6秒方式總計超聲破碎10-30分鐘的方式充分裂 解，之后，40, 000X g4°C離心60分鐘，收集細胞裂解液上清液，即為含有PB2-37截短體流感 病毒RNA聚合酶的上清液。
[0108] 上述裂解緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：250mM NaCl、25mM Tris，調節(jié)裂解緩沖液的pH值為8. 0。
[0109] 2、流感病毒RNA聚合酶的純化
[0110] A :親和層析
[0111] 將上述1得到的含有PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液吸取到預冷 的燒杯中，加入適量用裂解緩沖液清洗過的鎳柱磁珠 （Nickel Beads)，4°C結合3小時。 500 X g4°C離心3分鐘收集Beads，用裂解緩沖液清洗Beads5次。此時可將Beads加入一個 相應大小的空的層析柱中，進一步用清洗液清洗。（該步驟也可將離心獲得的上清液直接加 入含有鎳柱磁珠的柱子中進行結合，然后在柱上進行沖洗及洗脫過程以便親和純化目的復 合體）清洗充分后，加入洗脫緩沖液沖洗Beads，此時蛋白復合體從beads上被洗脫下來，通 常需要用2倍-5倍Beads體積洗脫目的蛋白，收集洗脫液，得親和層析純化PB2-37截短體 流感病毒RNA聚合酶（電泳檢測，結果與圖2 -致，說明得到目的蛋白）。
[0112] 用截留分子量為30, 000道爾頓的超濾管濃縮至5mL，得到親和層析后濃縮樣品。
[0113] 將濃縮樣品16, 000Xg4°C離心30分鐘，收集上清液（濃縮后蛋白聚合沉淀，收集 在上清液中存在的蛋白進行下述實驗）。
[0114] 上述洗脫緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl、250mM咪唑，10%丙三醇；調節(jié)洗脫緩沖液 的pH值為7.8。
[0115] B、離子交換層析
[0116] 通過親和層析初步純化的目的蛋白需要進一步純化，首選陽離子交換層析的方 法。
[0117] 過程如下：在AKTA FPLC或AKTA Purifier等層析設備上用低鹽緩沖液平衡陽離 子交換柱HiTrap S HP(含有介質beads5mL，來自于GE Healthcare,層析柱直徑約為1厘 米，長約為3厘米），用購自GE公司的FPLC系統(tǒng)Purif ierlO的上樣環(huán)將上述A得到的濃縮 樣品離心后的上清液）注入層析系統(tǒng)，使上述A獲得的親和層析后濃縮樣品上清液緩緩流 過離子交換柱，目的蛋白將結合在離子交換柱上。為了保險起見，收集未結合到離子交換柱 的樣品，可以再次將此流穿樣品上樣，以便獲得進一步的結合，之后繼續(xù)用低鹽緩沖液清洗 離子交換柱，直至紫外吸收值沒有明顯變化為止。調整緩沖液洗脫方式，用200mM至400mM 鹽濃度線性梯度洗脫樣品。
[0118] 結果如圖IA所示，收集200mM至400mM洗脫得到的洗脫液（對應的Peakl峰）為 離子交換層析純化后PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶（電泳檢測，結果與圖2 -致，說 明得到目的蛋白）。
[0119] 將離子交換層析純化后流感病毒RNA聚合酶用截留分子量為30, 000道爾頓的超 濾管濃縮至lmL，得到離子交換層析后濃縮樣品。
[0120] 將濃縮樣品16, OOOX g4°C離心30分鐘，收集上清液。
[0121] 上述低鹽緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl ;pH值為7. 8 ;
[0122] 上述高鹽緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸、IM NaCl ;pH7. 8。
[0123] C、凝膠層析
[0124] 用凝膠層析緩沖液平衡凝膠層析柱Superdex20016/60分子篩（GE healthcare, 柱徑1. 6厘米，柱長60厘米）將上述B獲得的離子交換層析后濃縮樣品上清液注入凝膠層 析系統(tǒng)，按每分鐘ImL的流速用凝膠層析洗脫緩沖液洗脫樣品。
[0125] 觀察紫外吸收值，根據(jù)出現(xiàn)紫外吸收峰對應的位置收集樣品。
[0126] 結果如圖1B，收集280nM或260nM下66±2mL處出峰對應的洗脫液（電泳檢測，結 果與圖2 -致，說明得到目的蛋白），為純化PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0127] 上述凝膠層析洗脫緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質按照如下終濃度溶解在 水中得到的溶液：25mM HEPES、200mM NaCl、lmM EDTA，調節(jié)凝膠層析緩沖液的pH值為7. 8。
[0128] 用截留分子量為30, 000-道爾頓的超濾管濃縮純化PB2-37截短體流感病毒RNA 聚合酶至lmL，得到濃縮PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0129] 將濃縮樣品16, OOOX g4°C離心30分鐘，收集上清液。
[0130] 三、流感病毒RNA聚合酶與流感病毒的核酸promoter雙鏈RNA結合
[0131] 為了結晶，必須將流感病毒RNA聚合酶結合核酸，通常在病毒中通常流感病毒RNA 聚合酶與其promoter核酸（RNA)結合，具體如下：
[0132] 1、promoter 核酸（RNA)的獲得
[0133] 首先，合成流感病毒的cRNA或vRNA promoter的兩條鏈，共四條RNA，序列分別為： 第一條：5' -AGUAGAAACAAGGGUG-3' 含有 16 個核苷酸；第二條：5' -CACCCUGCUUUUGCU-3'， 含有15個核苷酸；第三條：5' -AGCAAAAGCAGGGUG-3'，含有15個核苷酸；第四條： 5' -CACCCUUGUUUCUACU-3'，含有 16 個核苷酸。其中，第一與第二條 RNA 為 vRNA promoter 的兩條配對鏈，它們按1:1摩爾比混合，構成vRNA promoter。
[0134] 第三與第四條RNA為cRNA promoter的兩條配對鏈，它們按1:1摩爾比混合，構成 cRNApromoter。
[0135] 將vRNA promoter的兩條鏈按I: I混合，進行退火（Annealing)操作（95°C 5分鐘 后，迅速轉移到〇°C保溫），得到vRNA promoter。
[0136] 同樣，將cRNA promoter的兩條鏈按1:1混合，進行退火（Annealing)操作（95°C 5 分鐘后，迅速轉移到〇°C保溫），得到cRNA promoter。
[0137] 2、流感病毒RNA聚合酶與promoter雙鏈RNA結合
[0138] 在上述二的C方法凝膠層析所獲得的濃縮樣品上清液中加入vRNA promoter，在 (TC中保溫0. 5小時，得到結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0139] 將上述結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶按照上述二的C 方法凝膠層析純化，結果圖IC所示，收集280nM或260nM下66±2mL處出峰對應的洗脫液， 為純化結合vRNA promoter的流感病毒RNA聚合酶，說明加入RNA promoter之后蛋白質復 合體出峰位置仍然為66mL，說明結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶 為單體（約165KD)。
[0140] 采用同樣的方法將vRNA promoter結合PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶，結果 與上述一致。
[0141] 四、流感病毒RNA聚合酶的結晶
[0142] 由三得到的結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶和結合 cRNApromoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶，經濃縮后，達到20mg/mL濃度，可以用 于進行結晶實驗。
[0143] 采用商購的結晶試劑盒（hampton reaserch company)，將上述濃縮后結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶和結合cRNA promoter的PB2-37截短 體流感病毒RNA聚合酶，均在結晶緩沖液條件為5 % PEG20000、IOOmMTri sHCL (pH8. 5)、 250mMNaCL以及16°C溫度環(huán)境下結晶。
[0144] 結合vRNA promoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶結晶圖如圖7A所示， 結合cRNApromoter的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶結晶圖如圖7B所示，可以看出， 均獲得類似于長方形外觀的流感病毒RNA聚合酶晶體。
[0145] 為了確定此為目的蛋白結晶是否為流感病毒RNA聚合酶晶體,取出晶體后,使用 沉淀劑反復洗滌，除去粘在晶體上的蛋白溶液，洗凈的晶體進行SDS-PAGE電泳分析，結果 與圖2所示的結果一致，說明該晶體為PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶結晶晶體。
[0146] 實施例2、含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶的結晶
[0147] 本實施例預結晶的流感病毒RNA聚合酶聚合體的三個亞基包括PBl蛋白、PA蛋白 和PB2-130截短體；
[0148] PB2-130截短體的氨基酸序列為序列2自5'末端第1-130位氨基酸，對應的核苷 酸序列為序列5自5'末端第1-390位核苷酸。
[0149] 一、流感病毒RNA聚合酶的獲得
[0150] 1、流感病毒RNA聚合酶各亞基的表達
[0151] 1)、表達流感病毒RNA聚合酶各亞基的重組載體的構建
[0152] 由于后期要進行鎳柱純化，因此需要在亞基PB2-130或PBl的羧基端加入HIS 標簽，兩種都進行實驗，發(fā)現(xiàn)在復合體表達過程中，含有組氨酸標簽的蛋白只需在亞基 PB2-130和PBl任一個亞基上即可，沒有必要PBl及PB2亞基同時都含有組蛋白標簽。
[0153] 在亞基PB2-130的羧基端加入HIS標簽，擴增亞基PB2-130編碼基因的羧基端引 物為 5' ATCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAGGTTCCATGITTTAACCTTTCAACC3' 含終止子，含 6個串聯(lián)的組氨酸標簽；
[0154] 在亞基PB2-130的羧基端不加入HIS標簽，擴增亞基PB2-130編碼基因的羧基端 引物為：5' ATCTCGAGCTAGAAGGTTCCATG