毒RNA聚合酶的結(jié)晶
[0053] 本實(shí)施例預(yù)結(jié)晶的流感病毒RNA聚合酶聚合體的三個(gè)亞基包括PBl蛋白、PA蛋白 和PB2-37截短體；
[0054] PB2-37截短體的氨基酸序列為序列2自N末端第1-37位氨基酸，其編碼基因?yàn)樾?列5自5'末端第1-111位核苷酸。
[0055] 一、流感病毒RNA聚合酶的獲得
[0056] 1、流感病毒RNA聚合酶各亞基的表達(dá)
[0057] 1)、表達(dá)流感病毒RNA聚合酶各亞基的重組載體的構(gòu)建
[0058] -般性的說，通過基因合成方法根據(jù)NCBI網(wǎng)站公開的基因序列分別合成H5N1， WSN，PR8,1918，H3N2基因 DNA。針對各自序列，分別設(shè)計(jì)DNA引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得各病 毒的流感病毒RNA聚合酶各亞基的基因，按照Invitrogen的Bac-to-Bac系統(tǒng)使用指南手 冊，通過分子克隆方法，將三種亞基PBl，PB2及PA基因分別克隆到pFastBac基因表達(dá)載體 上，用于在昆蟲細(xì)胞表達(dá)這些基因。其中PBl及PA為全長基因，PB2為截?cái)囿w基因。
[0059] 由于后期要進(jìn)行鎳柱純化，因此需要在亞基PB2-37或PBl的羧基端加入HIS標(biāo) 簽，兩種都進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合體表達(dá)過程中，含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白只需在亞基PB2-37 和PBl任一個(gè)亞基上即可，沒有必要PBl及PB2亞基同時(shí)都含有組蛋白標(biāo)簽。
[0060] 在亞基PB2-37的羧基端加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-37編碼基因的羧基端引物 為 5'ATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCTGATGTGTATTTCTTGATTAT3'，含終止子，含 6 個(gè)串 聯(lián)的組氨酸標(biāo)簽；
[0061] 在亞基PB2-37的羧基端不加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-37編碼基因的羧基端引 物為：5' ATCTCGAGTTATCCTGATGTGTATTTCTTGATTAT3' ；
[0062] 在亞基PBl的羧基端加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PBl編碼基因的羧基端引物為：
[0063] 5 ' ATCTCGAGCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3 '，終止密碼 子之前加入六個(gè)連續(xù)排列的組氨酸（6HIS);
[0064] 在亞基PBl的羧基端不加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PBl編碼基因的羧基端引物為：
[0065] 5 ' ATCTCGAGCTATTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3 '。
[0066] 下面的實(shí)驗(yàn)以均為在PBl的羧基端加入HIS標(biāo)簽為例。
[0067] (1)重組載體 pFastBac-PB2_37 的獲得
[0068] 氨基端引物序列為：5 ' ATGGATCCATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAG3 ' ；羧基端引物為： 5 ' ATCTCGAGTTATCCTGATGTGTATTTCTTGATTAT3 '
[0069] 以PB2蛋白的編碼基因?yàn)槟０?，用上述氨基端引物和羧基端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至Ij PCR產(chǎn)物。
[0070] 將該P(yáng)CR產(chǎn)物分別酶切后連接到載體pFastBac質(zhì)粒上的克隆位點(diǎn)上，從而構(gòu)建出 表達(dá)PB2氨基端含1-37位氨基酸殘基片段的重組載體。
[0071] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列5自5'末端第1-111位核苷酸所示的 PB2-37截短體蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體pFASTBAC載體的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間， 表達(dá)PB2-37截短體蛋白，得到的重組載體，命名為pFastBac-PB2-37。
[0072] (2)重組載體pFastBac-PBl的獲得
[0073] 設(shè)計(jì) DNA 引物，其中 5' 端引物為：ATGGATCCATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTT ;
[0074] 在3'端引物上、終止密碼子之前加入六個(gè)連續(xù)排列的組氨酸（6HIS)為：ATCTCG AGCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG。
[0075] 以PBl合成的全長基因?yàn)槟０?，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物克隆到載體PFastBac上，得到重組載體。
[0076] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列表中序列4所示的PBl亞基編碼基因和 在其后面加入6個(gè)his標(biāo)簽編碼基因融合的DNA分子插入表達(dá)載體pFASTBAC中BamHI和 XhoI酶切位點(diǎn)得到的重組載體pFastBac-PBl,為重組供體質(zhì)粒pFastBac-PBl。
[0077] (3)重組載體pFastBac-PA的獲得
[0078] 氨基端引物為：5' ：ATGGATCCATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTT ;羧基端引物為：ATCT CGAGCTATTTTAGTGCATGTGTGAGGAAGGAGo
[0079] 以PA合成的全長基因?yàn)槟０?，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn) 物克隆到載體pFastBac上，得到重組載體。
[0080] 經(jīng)過測序,該重組載體為該重組載體為將序列表中序列表中序列6所示PA亞基的 編碼基因插入表達(dá)載體PFASTBAC的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間得到的重組載體，為重組供 體質(zhì)粒 pFastBac-PA。
[0081] 2)、重組昆蟲桿狀病毒的制備
[0082] (1)重組大腸桿菌和重組穿梭質(zhì)粒的獲得
[0083] 按照Invitrogen提供的實(shí)驗(yàn)手冊，將上述1)制備的重組載體pFastBac-PBl、 pFastBac-PA和pFastBac_PB2_37作為供體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DHlOBac，目的基因 在Helper質(zhì)粒表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶的協(xié)助下與穿梭質(zhì)粒Bacmid重組，得到重組菌PBl、重組菌PA 和重組菌PB2-37。
[0084] 提取重組菌PBl的Bacmid質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PBl ;
[0085] 提取重組菌PA的質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PA ;
[0086] 提取重組菌PB2-37的質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PB2-37。
[0087] (2)重組昆蟲桿狀病毒的制備
[0088] 流感病毒RNA聚合酶三個(gè)亞基能形成緊密的復(fù)合體。
[0089] 將重組穿梭載體Bacmid-PB2-37、Bacmid-PBl、Bacmid-PA分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9 細(xì)胞系，72小時(shí)分別收集上清液，得到表達(dá)PB2-37的重組昆蟲桿狀病毒、表達(dá)PBl的重組昆 蟲桿狀病毒、表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒，由此獲得第一代（Pl)各亞基表達(dá)的病毒。
[0090] 將上述產(chǎn)生的表達(dá)PB2-37的重組昆蟲桿狀病毒、表達(dá)PBl的重組昆蟲桿狀病毒、 表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒分別通過兩次轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系Sf9細(xì)胞以進(jìn)行病毒擴(kuò)增，得到 擴(kuò)增的P3代表達(dá)PB2-37的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PBl的重組昆蟲桿狀病毒、P3代 表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒。
[0091] 檢測滴度，P3代病毒滴度可以達(dá)到107pfu/mL以上，可以用于蛋白質(zhì)表達(dá)純化。若 病毒滴度較低，可用P3代病毒再次感染Sf9細(xì)胞系，得到滴度較高的P4代桿狀病毒用于蛋 白質(zhì)表達(dá)。
[0092] 3)、流感病毒RNA聚合酶的表達(dá)
[0093] 將上述2)得到P3代表達(dá)PB2-37的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PBl的重組昆 蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為108pfu/mL)混合后 按 10viruspaticles/Cell(M0I = 10 ;MOI:multiplicity of infection)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 High Five，48小時(shí)后收集培養(yǎng)液，500Xg4°C離心10分鐘收集細(xì)胞。將上述收獲的細(xì)胞按 照1:10 (質(zhì)量：體積）溶解于裂解緩沖液中（25mM Tris，250mM NaCl，pH8. 0)，使用超聲破 碎細(xì)胞，具體在〇°C冰液中保溫放置裝有細(xì)胞懸液的容器，在30w功率/50mL細(xì)胞溶液比率 下，按照超聲3秒停6秒方式總計(jì)超聲破碎30分鐘的方式充分裂解，之后，40, 000Xg4°C 離心30分鐘，收集細(xì)胞裂解液上清液，即為含有PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶的上清 液。可以反復(fù)離心2次以便盡可能除去雜質(zhì)。
[0094] 上述裂解緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質(zhì)按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：250mM NaCl、25mM Tris，調(diào)節(jié)裂解緩沖液的pH值為8. 0。
[0095] 2、流感病毒RNA聚合酶的鎳柱親和層析純化
[0096] 將上述1得到的含有PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液吸取到預(yù)冷 的燒杯中，加入適量用裂解緩沖液清洗過的鎳柱磁珠 （Nickel Beads)，4°C結(jié)合1小時(shí)。 500Xg4°C離心3分鐘收集Beads，用裂解緩沖液清洗Beads5次。加入洗脫緩沖液洗脫 Beads，收集洗脫液；30, 000X g4°C離心30分鐘，取上清液，即為純化的PB2-37截短體流感 病毒RNA聚合酶。
[0097] 用截留分子量為30, 000道爾頓的超濾管濃縮純化的PB2-37截短體流感病毒RNA 聚合酶至ImL。
[0098] 上述洗脫緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質(zhì)按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl、250mM咪唑，10%丙三醇；調(diào)節(jié)洗脫緩沖液 的pH值為7.8。
[0099] 將上述純化的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE檢測。
[0100] 結(jié)果如圖2所示，Lanel、2、3分別代表5微克純化后的PB2-37截短體流感病毒RNA 聚合酶、2. 5微克純化后的PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶、3微克純化后的PB2-37截 短體流感病毒RNA聚合酶；可以看出，得到分子量約為80KD的PBl亞基條帶、稍小于80KD 的PA條帶以及隱約可見的含有37個(gè)氨基酸殘基的PB2條帶（4KD)，表明，得到PB2-37截短 體流感病毒RNA聚合酶。
[0101] 分別回收每個(gè)亞基的條帶，送去進(jìn)行蛋白N端測序，驗(yàn)證得確得到H5N1流感病毒 RNA聚合酶的三個(gè)亞基，表明電泳檢測的目的大小的條帶得確為H5N1流感病毒RNA聚合酶 的三個(gè)亞基。
[0102] 計(jì)算含量，每升培養(yǎng)液可獲得Img的純化RNA聚合酶（PA-PB2-PB2-37)。
[0103] 二、流感病毒RNA聚合酶的大規(guī)模表達(dá)、純化
[0104] 1、流感病毒RNA聚合酶大規(guī)模表達(dá)
[0105] 使用波式反應(yīng)器或錐形瓶或其它類型的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使用SF900II SFM培養(yǎng)基懸 浮培養(yǎng)20L High Five細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長至2X106cells/mL時(shí)，將上述一得到的P3代 表達(dá)PB2-37的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PBl的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重 組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為108pf