流感病毒rna聚合酶結(jié)晶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法，尤其涉及一種 流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的表達、純化及結(jié)晶方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威脅人類社會的一個大問題，它具有廣泛 的宿主范圍包括人、豬、馬和禽類等，可以造成人類及動物上呼吸道感染，即流行性感冒，由 于其可以借空氣迅速的傳播，在上個世紀造成數(shù)次世界性的大流行。流感病毒屬于正黏病 毒科，為負鏈單鏈RNA分節(jié)段基因組病毒，其基因組分為8段，目前發(fā)現(xiàn)至少可編碼16個蛋 白。雖然目前存在不少抗流感病毒藥物和疫苗，但是這些藥物和疫苗主要針對流感病毒表 面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在藥物壓力下可以通過突變或者基因重組改變其表 面抗原，這些表面蛋白經(jīng)過突變的毒株將具有抗藥性，從而可能引起無法控制的流感流行。 為了解決藥物和疫苗的抗藥性問題，人們在考慮改變思路來研發(fā)廣譜性抗流感藥物。
[0003] 隨著對流感病毒復(fù)制機制的研究，人們逐漸將眼光集中在病毒的核糖核蛋白RNP 上。流感病毒RNP是流感病毒復(fù)制的核心組分。與病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更 為保守，它由病毒基因組、RNA聚合酶和纏繞在病毒基因組RNA上的多個核蛋白組成，負責(zé) 病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。流感病毒聚合酶是流感病毒復(fù)制的核心機器，它是由PA、PB1和PB2三 個亞基組成的大小約為250千道爾頓（KDa)的三元復(fù)合物，可以產(chǎn)生三種類型的RNA，分別 是cRNA、vRNA和mRNA，該聚合酶在病毒的生命活動中既參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程， 同時有文章報道該復(fù)合物也參與病毒的組裝。
[0004] 盡管人們通過生物化學(xué)，遺傳學(xué)，生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)對流感病毒聚合酶進 行了各方面的深入研究，提出了越來越精細的模型，關(guān)于聚合酶的工作機制方面仍然有很 多關(guān)鍵問題尚無法解決，例如：聚合酶如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程；在復(fù)制過程中，兩個聚合 酶分子如何協(xié)調(diào)以啟動和終止復(fù)制等；此外，聚合酶還參與病毒的組裝和抵御宿主免疫系 統(tǒng)。為了解決這些問題，十分需要一個原子分辨率的聚合酶整體結(jié)構(gòu)，然而由于流感病毒聚 合酶是一個250KD的復(fù)合物，為了以行使其多種功能，可能具有多種構(gòu)象，這給結(jié)構(gòu)生物學(xué) 研究、尤其是晶體結(jié)構(gòu)的獲得造成了極大的障礙，因此即使經(jīng)過了數(shù)十年的努力，仍沒有流 感病毒聚合酶整體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)得到報道。
[0005] 目前，人們在重組蛋白表達純化，晶體優(yōu)化和結(jié)構(gòu)解析方面積累了大量的經(jīng)驗，通 常情況下，純化得到足夠量的穩(wěn)定均一的蛋白質(zhì)、并由此獲得結(jié)晶仍然是大分子晶體結(jié)構(gòu) 分析的主要瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：為先將流感病毒RNA聚合酶的PBl亞基編碼基 因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達、純化，得到RNA聚 合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結(jié)合形成復(fù)合體，再將所述復(fù)合體結(jié)晶，得到流感病毒RNA 聚合酶晶體；
[0008] 所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N = 37-280中的任一自然數(shù)。
[0009] 上述方法中，所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基 組成；N = 37-130中的任一自然數(shù)。
[0010] 上述方法中，所述PB2亞基截短體為如下1)或2)或3):
[0011] 1)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前37位的氨基酸殘基形成的蛋白；
[0012] 2)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前130位的氨基酸殘基形成的蛋白；
[0013] 3)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前103位的氨基酸殘基形成的蛋白。
[0014] 上述方法中，所述昆蟲細胞為High Five細胞；
[0015] 所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為H5N1、HlNl或 H3N2。
[0016] 上述方法中，所述將流感病毒RNA聚合酶的PBl亞基編碼基因、PA亞基編碼基因 和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達采用Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒 表達系統(tǒng)，所述Bac-t〇-BacBac-t〇-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中的供體質(zhì)粒為pFastBac，大腸 桿菌為DHlOBac，昆蟲細胞為Sf9。
[0017] 上述方法中，所述PBl亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示；
[0018] 所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示；
[0019] 所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示；
[0020] 1)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-37 位；
[0021] 2)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-130 位；
[0022] 3)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-103 位。
[0023] 上述方法中，所述PBl亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示；
[0024] 所述PA亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6所示；
[0025] 1)所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5' 末端第1-111位；
[0026] 2)所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5' 末端第1-390位；
[0027] 3)所示的所述PA亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5'末 端第1 _309位。
[0028] 上述方法中，所述純化為將共表達得到的所述RNA聚合酶依次經(jīng)親和層析、離子 交換層析和凝膠層析，得到純化后的RNA聚合酶；
[0029] 所述結(jié)晶采用的緩沖液由終濃度為2 % -30 %的PEG 1000-20000、終濃度為 50mM-500mMNaCL和濃度為100mM、pH值為8. 5的TrisHCL緩沖液組成；
[0030] 所述結(jié)晶采用的溫度為4°C -20°c。
[0031] 由上述的方法制備的RNA聚合酶晶體也是本發(fā)明保護的范圍。
[0032] 上述的RNA聚合酶晶體在抗流感病毒藥物篩選或疫苗設(shè)計和制備中的應(yīng)用也是 本發(fā)明保護的范圍。
[0033] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用了不同長度保留氨基端的PB2蛋白截短體與流感 病毒RNA聚合酶復(fù)合體其它兩個亞基PA和PBl全長蛋白進行共表達、純化及復(fù)合體組裝獲 得的不同的小復(fù)合體，這些小復(fù)合體均可在加入vRNA后結(jié)晶形成流感病毒RNA聚合酶晶 體。因此推斷，不論使用何種流感病毒毒株，PB2亞基氨基端的這一區(qū)間內(nèi)任何截短體都可 能幫助獲得流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體結(jié)晶。
[0034] 本發(fā)明的方法解決了長久以來的一個重要問題，即如何有效表達純化一個含有大 部分流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體成分的復(fù)合體，特別是含有完整PBl結(jié)構(gòu)的該蛋白復(fù)合 物，并使之結(jié)晶，這一方法不僅為流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，同時，對抗流感病 毒藥物篩選、廣譜性疫苗和藥物的設(shè)計研發(fā)進程也將具有重要意義和應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0035] 圖1為含有PB2-37截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體純化過程中圖譜
[0036] 圖2為含有PB2-37截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體純化SDS-PAGE電泳圖譜
[0037] 圖3為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體分子篩純化圖譜
[0038] 圖4為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的純化結(jié)果
[0039] 其中，圖4A為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體電泳圖，1-2為鎳 柱層析后電泳、3為離子交換后電泳、4-5為分子篩層析后電泳
[0040] 圖4B為離子交換圖譜，藍色曲線（上面的曲線）為樣品在UV280的吸收情況；紅 色曲線（下面的曲線）代表UV260吸收；黑色曲線代表離子交換鹽濃度的增加過程。
[0041] 圖4C為分子篩純化圖譜，其中黑色曲線代表不加 RNA時UV280和UV260吸收情況， 藍色曲線代表加入RNA后復(fù)合體洗脫UV280和UV260吸收情況。
[0042] 圖5為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體純化后的電泳圖譜
[0043] 圖6為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體電鏡結(jié)果及結(jié)晶圖片
[0044] 其中A和B為二體及四體的電鏡結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果、C為四體加入vRNA后的結(jié)晶照片、 D為結(jié)晶電泳檢測圖
[0045] 圖7為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的結(jié)晶圖片
【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] 實驗所用昆蟲表達載體pFASTBAC和pFastBac-Dual及細胞培養(yǎng)基SF900II SFM 均購自Invitrogen公司。所需RNA均由Takara公司合成，鎳親和柱購自Qiagen公司 (Ni-NTA Agarose，產(chǎn)品目錄號：30230)，SP陽離子交換柱（HITRAP SP HP，產(chǎn)品目錄號： 17-1152-01)和 Superdex20016/60 凝膠層析柱（HiLoadl6/600Superdex200pg，產(chǎn)品目錄 號：28-9893-35)購自GE公司。檢測PA、PB1和PB2所用抗體通過表達相應(yīng)蛋白多肽，免疫 兔獲得多克隆抗體，經(jīng)過實驗驗證特異性良好。
[0049] 昆蟲細胞表達體系采用的是Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng) (Bac -to-BaclSlBaculovirus Expression System，目錄號：10359-016)，其中供體質(zhì)粒為 pFastBac，進行重組病毒構(gòu)建的大腸桿菌為DHlOBac (該菌株含有可在細菌和昆蟲之間轉(zhuǎn) 移和擴增的穿梭質(zhì)粒Bacmid和能表達轉(zhuǎn)座酶的Helper質(zhì)粒），昆蟲細胞為Sf9。所用昆蟲 細胞培養(yǎng)基為Invitrogen公司的SF900II SFM。
[0050] 本發(fā)明的實施例均以流感病毒毒株Influenza virus/A/Guangdong/ g〇〇Se/196(H5Nl)(以下簡稱：H5N1)為例，但其余的流感病毒尤其是A型流感病毒毒株中的 流感病毒RNA聚合酶的三個亞基也可以通過本發(fā)明的方法進行結(jié)晶。
[0051] H5N1的RNA聚合酶聚合體的三個亞基包括PBl蛋白、PA蛋白和PB2蛋白，且PBl 蛋白的氨基酸序列為序列1，其編碼基因的核苷酸序列為序列4 ;PA蛋白的氨基酸序列為序 列3,其編碼基因的核苷酸序列為序列6 ;PB2蛋白的氨基酸序列為序列2,其編碼基因的核 苷酸序列為序列5。
[0052] 實施例1、含有PB2-37截短體的流感病