ITTTAACCTTTCAACC3' ；
[0155] 下面的實(shí)驗(yàn)以均為在PBl的羧基端加入HIS標(biāo)簽為例。
[0156] (1)重組載體 pFastBac-PB2_130 的獲得
[0157] 氨基端引物序列為：5 ' ATGGATCCATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAG3 ' ；羧基端引物為： 5' ATCTCGAGCTAGAAGGTTCCATGITTTAACCTTTCAACC3'（含終止子，不含組氨酸標(biāo)簽）。
[0158] 以PB2蛋白的編碼基因?yàn)槟０?，用上述氨基端引物和羧基端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至Ij PCR產(chǎn)物。
[0159] 將該P(yáng)CR產(chǎn)物分別酶切后連接到載體pFastBac質(zhì)粒上的克隆位點(diǎn)上，從而構(gòu)建出 表達(dá)PB2氨基端含1-130位氨基酸殘基片段的重組載體。
[0160] 經(jīng)過(guò)測(cè)序，該重組載體為將序列表中序列5自5'末端第1-390位核苷酸所示的 PB2-130截短體蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體pFASTBAC載體的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間， 表達(dá)PB2-130截短體蛋白，得到的重組載體，命名為pFastBac-PB2-130。
[0161] (2)重組載體pFastBac-PBl的獲得：與實(shí)施例1方法相同。
[0162] (3)重組載體pFastBac-PA的獲得：與實(shí)施例1方法相同。
[0163] 2)重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的制備：與實(shí)施例1方法基本相同，不同的是將 pFastBac-PB2-37替換為pFastBac-PB2-130,得到P3代表達(dá)PB2-130的重組昆蟲(chóng)桿狀病 毒、P3代表達(dá)PBl的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒。
[0164] 3)、流感病毒RNA聚合酶的表達(dá)
[0165] 按照實(shí)施例1的方法，將上述2)得到P3代表達(dá)PB2-130的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒、P3 代表達(dá)PBl的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒等滴度量（滴度均為 108pfu/mL)混合后轉(zhuǎn)入細(xì)胞High Five，裂解，得到含有PB2-130截短體流感病毒RNA聚合 酶的上清液。
[0166] 2、流感病毒RNA聚合酶的鎳親和層析純化
[0167] 將上述1得到的含有PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液按照上述實(shí)施 例1的方法進(jìn)行鎳柱親和層析純化，得到純化的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0168] 將上述純化的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE檢測(cè)。
[0169] 結(jié)果如圖5所示，1-130為純化的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶，可以看出， 得到分子量約為80KD的PBl亞基條帶、稍小于80KD的PA條帶以及14KD PB2的130個(gè)氨 基酸殘基條帶，表明，得到PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0170] 分別回收每個(gè)亞基的條帶，送去進(jìn)行蛋白N端測(cè)序，驗(yàn)證得確得到H5N1流感病毒 RNA聚合酶的三個(gè)亞基，表明電泳檢測(cè)的目的大小的條帶得確為H5N1流感病毒RNA聚合酶 的三個(gè)亞基。
[0171] 計(jì)算含量，每升培養(yǎng)液可獲得0. 8mg的純化RNA聚合酶（PA-PB1-PB2-130)。
[0172] 二、流感病毒RNA聚合酶的大規(guī)模表達(dá)、純化
[0173] I、流感病毒RNA聚合酶大規(guī)模表達(dá)
[0174] 按照實(shí)施例1的方法將P3代表達(dá)PB2-130的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒、P3代表達(dá)PBl的 重組昆蟲(chóng)桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒等滴度量（滴度均為108pfu/mL)混 合后按1% (體積/體積）加入High Five細(xì)胞、培養(yǎng)、裂解，收集上清液，得到含有PB2-130 截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液。
[0175] 2、流感病毒RNA聚合酶的純化
[0176] A :親和層析
[0177] 按照實(shí)施例1的方法將上述1得到的含有PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶的 上清液進(jìn)行鎳柱親和層析，用2倍-5倍Beads體積洗脫目的蛋白，收集洗脫液，得親和層析 純化PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0178] 電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4A的泳道1和2所示，可以看出，得到分子量約為80KD的 PBl亞基條帶、稍小于80KD的PA條帶以及14KD PB2的130個(gè)氨基酸殘基條帶，表明，得到 PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0179] B、離子交換層析
[0180] 按照實(shí)施例1的方法將上述A純化后的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶進(jìn)行 離子交換層析，用200mM至400mM鹽濃度線性梯度洗脫樣品。
[0181] 結(jié)果如圖4B所示，收集200mM至400mM洗脫得到的洗脫液（對(duì)應(yīng)的主峰）為離子 交換層析純化后PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶.
[0182] 電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4A的泳道3所示，說(shuō)明得到目的蛋白。
[0183] C、凝膠層析
[0184] 按照實(shí)施例1的方法將上述B純化后的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶的上 清液進(jìn)行凝膠層析，結(jié)果如圖3所示，收集280nM或260nM下大約為58毫升處出峰對(duì)應(yīng)的 洗脫液，對(duì)應(yīng)分子量為復(fù)合體二體大小，這與純化表達(dá)的含有PB2-37的流感病毒RNA聚合 酶復(fù)合體樣品出峰位置不同，為純化PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0185] 電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4A的泳道5和6所示，說(shuō)明得到目的蛋白。
[0186] 三、流感病毒RNA聚合酶與流感病毒的核酸promoter雙鏈RNA結(jié)合
[0187] 1、promoter核酸（RNA)的獲得：與實(shí)施例1相同。
[0188] 2、流感病毒RNA聚合酶與promoter雙鏈RNA結(jié)合
[0189] 與實(shí)施例1基本相同，不同的是替換為純化PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶， 得到結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter的 PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0190] 將結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶和未結(jié)合RNA的 PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶凝膠層析純化。
[0191] 結(jié)果圖4C所示，收集280nM下53毫升處出峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，為結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶（四體形式，分子量約為720KD)，收集 280nM下68毫升出峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，為PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶（單體形式， 分子量約為180KD)，58毫升處出峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，為結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短 體流感病毒RNA聚合酶（二體形式，分子量約為360KD)，表明PB2-130截短體流感病毒RNA 聚合酶主要以二體（未加 RNA啟動(dòng)子時(shí)）和四體（加入RNA啟動(dòng)子后）形式存在，而不是 PB2-37截短體流感病毒RNA聚合酶的單體存在形式。
[0192] 結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter 的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)果無(wú)顯著差異。
[0193] 將PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶二體和四體進(jìn)行電鏡結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果如圖 6A和6B所示，6A為二體，6B為四體。
[0194] 四、流感病毒RNA聚合酶的結(jié)晶
[0195] 采用商購(gòu)的結(jié)晶試劑盒（hampton reaserch company)，將上述濃縮后結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶和結(jié)合cRNA promoter的PB2-130截 短體流感病毒RNA聚合酶，均在結(jié)晶緩沖液條件為2% PEG10000、100mMTrisHCL(pH8. 5)、 50mMNaCL以及4°C溫度環(huán)境下結(jié)晶。
[0196] 結(jié)合vRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶圖如圖6C和7C 所示，結(jié)合cRNA promoter的PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶圖如圖7D所示，可 以看出，均獲得類(lèi)似于長(zhǎng)方形外觀的流感病毒RNA聚合酶晶體。
[0197] 為了確定此為目的蛋白結(jié)晶是否為流感病毒RNA聚合酶晶體，取出晶體后，使用 沉淀劑反復(fù)洗滌，除去粘在晶體上的蛋白溶液，洗凈的晶體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果 如圖6D所示，說(shuō)明該晶體為PB2-130截短體流感病毒RNA聚合酶晶體。
[0198] 實(shí)施例3、含有PB2-103截短體的流感病毒RNA聚合酶的結(jié)晶
[0199] 本實(shí)施例預(yù)結(jié)晶的流感病毒RNA聚合酶聚合體的三個(gè)亞基包括PBl蛋白、PA蛋白 和PB2-103截短體；
[0200] PB2-103截短體的氨基酸序列為序列2自5'末端第1-103位氨基酸，對(duì)應(yīng)的核苷 酸序列為序列5自5'末端第1-309位核苷酸。
[0201] -、流感病毒RNA聚合酶的獲得
[0202] 1、流感病毒RNA聚合酶各亞基的表達(dá)
[0203] 1)、表達(dá)流感病毒RNA聚合酶各亞基的重組載體的構(gòu)建
[0204] 由于后期要進(jìn)行鎳柱純化，因此需要在亞基PB2-130或PBl的羧基端加入HIS 標(biāo)簽，兩種都進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合體表達(dá)過(guò)程中，含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白只需在亞基 PB2-103和PBl任一個(gè)亞基上即可，沒(méi)有必要PBl及PB2亞基同時(shí)都含有組蛋白標(biāo)簽。
[0205] 在亞基PB2-103的羧基端加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-103編碼基因的羧基端引 物為 5' ATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCCATTCCTGTTCCACCAACTTAC3' 含終止子，含 6 個(gè) 串聯(lián)的組氨酸標(biāo)簽；
[0206] 在亞基PB2-103的羧基端不加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-103編碼基因的羧基端 引物為：5' ATCTCGAGTTACCCATTCCTGTTCCACCAACTTAC3' ；
[0207] 下面的實(shí)驗(yàn)以均為在PBl的羧基端加入HIS標(biāo)簽為例。
[0208] (1)重組載體 pFastBac-PB2_130 的獲得
[0209] 以PB2蛋白的編碼基因?yàn)槟０澹蒙鲜霭被艘锖汪然艘镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至Ij PCR產(chǎn)物。
[0210] 將該P(yáng)CR產(chǎn)物分別酶切后連接到載體pFastBac質(zhì)粒上的克隆位點(diǎn)上，從而構(gòu)建出 表達(dá)PB2氨基端含1-103位氨基酸殘基片段的重組載體。
[0211] 經(jīng)過(guò)測(cè)序，該重組載體為將序列表中序列5自5'末端第1-309位核苷酸所示的 PB-103截短體蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體pFASTBAC載體的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間， 表達(dá)PB-103截短體蛋白，得到的重組載體，命名為pFastBac-PB2-103。
[0212] (2)重組載體pFastBac-PBl的獲得：與實(shí)施例1方法相同。
[0213] (3)重組載體pFastBa