)的結(jié)構(gòu)如下所示：
用2. 87g(0. 012mol) 3-甲氧基-4-羥基苯乙烯甲氨基甲酰肼代替2. 39g(0. 012mol)3， 4，5-三羥基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同實施例6，得化合物（7 )，收率76%。
[0024] 實施例8 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氫-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亞甲基-6,9-二甲基-3，12-橋氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H) 醇（8)的制備； 化合物（8)的結(jié)構(gòu)如下所示：
用2.97g(0.012mol) 3,4,5_三甲氧基苯甲氨基甲酰肼代替2.39g(0.012mol)3,4， 5-三羥基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同實施例6，得化合物（8 )，收率82%。
[0025] 實施例9 氨基脲二氫青蒿抑制腫瘤細胞增殖的體外評價 1材料與方法 1. 1細胞株 非小細胞肺癌A549和宮頸癌細胞Hela，購自美國ATCC。
[0026] L 2主要試劑和藥品 高糖DMEM培養(yǎng)液，購于美國GIBCO公司； 胎牛血清，購于中科晨宇（北京）貿(mào)易有限公司； 胰蛋白酶，購于西安璟程生物科技有限公司； 青霉素，購于華北制藥有限公司； 鏈霉素，購于華北制藥有限公司； 二甲基亞砜（DMSO)，購于格里斯(天津）醫(yī)藥化學技術(shù)有限公司； 雙氫青蒿素純品，廣州新南方青蒿藥業(yè)有限公司提供。
[0027] 1. 3主要儀器 NUNC細胞培養(yǎng)板，Denmark公司； HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學儀器有限公司； 細胞計數(shù)板，上海半島實業(yè)有限公司。
[0028] L 4溶液配制 1. 4. 1 20萬U/ml青霉素 青霉素（一瓶）80萬U，生理鹽水4mL充分溶解后0.22 ym微孔濾膜過濾除菌、分 裝，-20°C保存。
[0029] L 4. 2 20 萬 U/ml 鏈霉素 鏈霉素（一瓶）100萬U，生理鹽水5mL，充分溶解后0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌、分 裝，20°C保存。
[0030] 1.4.3高糖DMEM完全培養(yǎng)液 高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基90mL,胎牛血清IOmL, 20萬U/mL青霉素50 uL，20萬U/mL鏈 霉素50 uL，配制成含10%胎牛血清，lOOU/mL青霉素及l(fā)OOU/mL鏈霉素的高糖DMEM完全培 養(yǎng)液，4° C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 1.4. 4凍存液配制 高糖DMEM培養(yǎng)液7mL，DMSO ImL，胎牛血清2mL。
[0032] L 4. 5四甲基偶氮啤鹽（MTT) 稱 250mg MTT (Sigma 公司）溶于 50mL 0· 01mol/L PBS 溶液中，0· 2iim 濾膜過 濾，4° C避光保存，2周內(nèi)使用。
[0033] 1. 4. 6 酸鹽緩沖液（PBS) 8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na2HP04,0 . 24g KH2PO4溶于 800mL 雙蒸水中，鹽酸調(diào) pH值為7. 4,加蒸餾水至1L，高壓滅菌后備用。
[0034] 1. 4. 7細胞裂解液 20mmol/L MOPS, 0· 15mmol/LNaCl, 1% NP-40(去氧膽酸鈉 1%), lmmol/L EDTA, 1%SDS，用雙蒸水攪拌溶解。將上述液體混勻后配制成含10%DMS0的凍存液，分裝，-20°C 保存。
[0035] 1. 4. 8雙氫青蒿素溶液 用少量DMSO溶液將純品溶解配制成lOOmmol/L的母液，超聲波助溶，4° C保存，實 驗前用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMS0終濃度〈1%)。
[0036] 2實驗方法 2. 1細胞的培養(yǎng) 肺癌A549細胞和宮頸癌Hela細胞均為貼壁細胞，培養(yǎng)于高糖的DMEM完全培養(yǎng)液，放 置于37°C，5%C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔兩天換液。當細胞生長接近融合，鋪滿約90% 培養(yǎng)瓶底時，進行接種。
[0037] 2. 2接種細胞 當細胞貼壁長滿至80-90%時，用胰蛋白酶消化細胞，以高糖DMEM完全培養(yǎng)液將細胞 吹打制備成單細胞懸液。將對數(shù)生長期的細胞以3000-4000細胞/孔的量接種于96孔板， 每孔為l〇〇uL。
[0038] 2. 3加藥處理 待細胞貼壁培養(yǎng)l-2d后，吸掉原有培養(yǎng)基，將藥物分別配制成一定濃度，并對半稀 釋，后一孔藥物濃度是前一孔的一半，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0039] 2. 4 MTT 法檢測 將加入藥物的培養(yǎng)板放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱孵育72h后，每孔加入ZOyg/mL MTT溶液，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中保溫4h，小心吸掉孔中原有培養(yǎng)液，每孔加入 150 μ LDMS0,振蕩后靜置lOmin，待結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀測SA49(lnm值，并計算抑制 率（%) = (1-實驗組OD值/空白對照組OD值）X 100。
[0040] 2. 5半數(shù)抑制濃度（IC50)計算 將配好的藥物用含10%的DMEM培養(yǎng)基稀釋，青蒿素100 μ g/mL和雙氫青蒿素100 μ g/ mL溶液，根據(jù)對半稀釋方法加藥，每個濃度設(shè)3個復孔，空白對照9個復孔，MTT法檢測， 計算出不同濃度藥物的抑制率，將劑量與對應(yīng)抑制率輸入Shmm公司IC50. Exel. 0版本軟 件計算藥物的IC50。
[0041] 3 結(jié)果 所制備的氨基脲二氫青蒿素在體外對肺癌A549和宮頸癌細胞Hela有明顯抑制作用。 各劑量組的抑制率與二氫青蒿素對比，具有顯著性，如下表1和表2所示：
【主權(quán)項】
1. 通式I的氨基脲二氫青蒿素衍生物或其藥學可接受的水合物、鹽，其特征是它具有 如下通式：式中，R為H、各種烴基，所述烴基可以被鹵素、氨基、取代氨基、羧基、羥基、酯基、氰基、 硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z為0, S，NH。2. 根據(jù)權(quán)利1所述的通式I的氨基脲二氫青蒿素衍生物或其藥學可接受的水合物、鹽， 其特征在于：R為H、各種烴基，優(yōu)選H、取代苯甲基。3. 根據(jù)權(quán)利1所述的通式I的氨基脲二氫青蒿素衍生物或其藥學可接受的水合物、鹽， 其特征在于：Z為0, S，NH，優(yōu)選0, S。4. 根據(jù)權(quán)利1所述的通式I的氨基脲二氫青蒿素衍生物或其藥學可接受的水合物、鹽， 所述通式I化合物的具體實例包括： (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氫-3-(氨基硫代甲酰肼基)亞甲基-6,9-二 甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（1); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氫-3-(氨基甲酰肼基）亞甲基-6,9-二甲 基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，3-]_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（2); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氫-3-(甲氨基甲酰肼基）亞甲基-6,9-二 甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（3); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氫-3-(苯氨基甲酰肼基）亞甲基-6,9-二 甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（4); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氫-3-(胍氨基）亞甲基-6,9-二甲基-3， 12-橋氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（5); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氫-3-(3,4,5-三羥基苯甲氨基甲酰肼基） 亞甲基-6,9-二甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇 (6)； (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氫-3-(3-甲氧基-4-羥基苯乙烯甲氨基 甲酰肼基)亞甲基-6,9-二甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（7); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氫-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亞甲基-6,9-二甲基-3，12-橋氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇 醇（8)〇5. 通式為I的化合物的制備方法，如下所示：其中，X = Br, Cl ;Z = S，0，NH;R = H、烴基，其特征在于，所述方法以3-鹵代二氫青 蒿素和取代的氨基脲為原料，一定的溫度下，一定的溶劑中，使用特殊的催化劑和縛酸劑， 通過親核取代反應(yīng)，合成氨基脲二氫青蒿素。6. 根據(jù)權(quán)利1和5所述的通式I的合成方法，所述反應(yīng)溶劑為DMF、乙腈、THF、氯仿、二 氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，優(yōu)選DMF、乙腈、THF。7. 根據(jù)權(quán)利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述催化劑為碘化物、碘鹽， 優(yōu)選碘金屬鹽。8. 根據(jù)權(quán)利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述縛酸劑為各種有機和無 機堿，優(yōu)選吡啶、三乙胺。9. 根據(jù)權(quán)利1所述的通式I的氨基脲二氫青蒿素衍生物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及氨基脲二氫青蒿素衍生物（通式I）或其藥學可接受的水合物、鹽。其中，R為H、各種烴基，所述烴基可以被鹵素、氨基、取代氨基、羧基、羥基、酯基、氰基、硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z為O，S，NH。本發(fā)明的氨基脲二氫青蒿素對Hela和A549細胞有顯著的抑制作用，因此，本發(fā)明的氨基脲二氫青蒿素有較好的抗腫瘤效果。本發(fā)明公開了其制法。
【IPC分類】A61P35/00, C07D493/20, A61K31/357
【公開號】CN104892626
【申請?zhí)枴緾N201510283438
【發(fā)明人】張寶華, 史蘭香, 劉斯婕, 郭瑞霞
【申請人】石家莊學院
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月29日