胞、CD8+T細胞、巨瞻細胞、嗜 酸性細胞(eosinophil)和NK細胞的作用。由于CD4+T細胞在抗腫瘤免疫中是重要的,因 此可將對于該些細胞的活化的影響作為指標,用來評價膚的抗腫瘤免疫力誘導(dǎo)作用。
[0092] 對于使用樹突細胞值C)作為抗原呈遞細胞誘導(dǎo)的殺傷T細胞而言,評價它們的誘 導(dǎo)效果的方法是本領(lǐng)域公知的。在抗原呈遞細胞中,DC具有最強的殺傷T細胞誘導(dǎo)效果。 在此方法中,首先,將測試膚與DC接觸,然后將DC與T細胞接觸。從與DC接觸過的T細胞 中檢測出對祀細胞具有細胞毒作用的T細胞。如果T細胞顯示針對祀細胞的細胞毒活性, 則意味著測試膚具有誘導(dǎo)細胞毒T細胞的活性。例如,可使用標記的腫瘤細胞的裂解 作為指標,檢測殺傷T細胞針對祀細胞如腫瘤的活性?;蛘?,可使用3H-胸腺喀晚攝取活性 或LDH(乳糖脫氨酶)釋放作為指標來評價腫瘤細胞損害的程度。
[0093] 通過該些方法確認表現(xiàn)殺傷T細胞誘導(dǎo)活性的測試膚,是表現(xiàn)DC-活化作用和隨 后的殺傷T細胞誘導(dǎo)活性的膚。因此,表現(xiàn)誘導(dǎo)針對腫瘤細胞的殺傷T細胞的活性的膚可 用作針對呈遞F0XM1的癌癥的疫苗。此外,已通過與膚接觸而獲得了誘導(dǎo)針對癌癥的殺傷 T細胞之能力(活性)的抗原呈遞細胞,可用作針對癌癥的疫苗。此外,通過抗原呈遞細胞 呈遞膚而獲得了細胞毒性的殺傷T細胞還可用作針對癌癥呈遞F0XM1的疫苗。利用抗原呈 遞細胞和殺傷T細胞進行抗腫瘤免疫,使用該樣的抗腫瘤免疫的癌癥治療方法稱為細胞免 疫療法(cytoimmunotherapy)。
[0094] 通常,當使用膚進行細胞免疫療法時,可通過組合具有不同結(jié)構(gòu)的多個膚來增強 誘導(dǎo)殺傷T細胞的效率。因此,當用蛋白質(zhì)片段刺激DC時,使用多個類型的膚片段的混合 物是有利的。
[0095] 膚對抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)還可通過觀察針對腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來評價。例 如,當在用膚免疫的實驗室動物中誘導(dǎo)出針對膚的抗體,而該些抗體抑制腫瘤細胞的生長、 增殖和/或轉(zhuǎn)移時,則確定該膚可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力。
[0096] 可通過施用本發(fā)明的疫苗來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力,而為治療和/或預(yù)防癌癥提 供可能。治療癌癥和/或預(yù)防癌癥發(fā)生的效果可包括抑制癌細胞生長、癌細胞的退行 (regression)和癌細胞產(chǎn)生的抑制?;及┌Y的個體的死亡率降低、血中的腫瘤標志物減 少、和與癌癥有關(guān)的可檢測癥狀的減少也包括在治療和/或預(yù)防癌癥的效果中。優(yōu)選地, 疫苗針對癌癥的治療和/或預(yù)防效果與無疫苗施用的對照的情況相比是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。 例如,優(yōu)選效果是下的顯著性水平觀察到的。統(tǒng)計學(xué)方法如Studentt-檢驗、 Mann-WhitneyU檢驗、AN0VA等可用于確定統(tǒng)計顯著性。
[0097] 在本發(fā)明中,受試者優(yōu)選是哺乳動物。哺乳動物的實例包括人、非人靈長類 (non-humanprimate)、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛(cattle),但不限于此。
[009引本發(fā)明的膚可體內(nèi)或回體(exvivo)施用于受試者。此外,為了產(chǎn)生用于治療和/ 或預(yù)防癌癥的免疫原性組合物,可使用本發(fā)明的免疫原性膚,也就是,選自SEQIDN0:1至 3的氨基酸序列的九膚和其突變膚。
[0099] 更具體地,本發(fā)明提供用于治療腫瘤或預(yù)防腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等的藥劑,其包括一種 或多種本發(fā)明的膚作為活性成分。本發(fā)明的膚特別有用于治療腫瘤如膜腺癌、膽管細胞癌、 胃癌、結(jié)腸癌、非小細胞肺癌、睪丸癌、子宮頸癌、骨肉瘤和軟組織肉瘤。
[0100] 本發(fā)明的膚可作為通過常規(guī)配制方法配制的藥劑直接施用于受試者。該樣的配制 物除了本發(fā)明的膚之外,可根據(jù)需要包含可藥用的載體、賦形劑等。本發(fā)明的藥劑可用于治 療和/或預(yù)防多種腫瘤。
[0101] 此外,為了有效地建立細胞免疫力,包含一種或多種本發(fā)明的膚作為活性成分的 用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥劑中可混入佐劑。所述藥劑可與其他活性成分(如抗腫瘤劑) 一起共施用。適當?shù)闹苿┻€包括顆粒。適當?shù)淖魟┟枋鲇谖墨I(JohnsonAG. (1994)Clin. Microbiol.Rev.,7:277-89)中。佐劑的實例包括弗氏不完全佐劑、BCG、海藻糖二霉酪酸醋 (trehalosedimycolate) (TDM)、脂多糖(LP巧、硫酸侶鐘佐劑、娃石佐劑、磯酸侶、氨氧化侶 和明孤(alum),但不限于此。此外,可方便地使用脂質(zhì)體配制物、其中藥物結(jié)合于具有數(shù)微 米直徑的珠子的顆粒制劑和其中脂質(zhì)結(jié)合于上述膚的制劑。施用方法可為口服施用、皮內(nèi) 注射、皮下注射、靜脈注射等,并可包括全身施用(systemica血inistration)和祀腫瘤附 近的局部施用。
[0102] 本發(fā)明的膚的劑量可根據(jù)要治療的疾病、患者的年齡和體重、施用方法等而適當 地調(diào)節(jié)。劑量通常為0.OOlmg至lOOOmg,優(yōu)選0.Olmg至lOOmg,更優(yōu)選0.Img至lOmg。優(yōu) 選地,幾天一次到幾個月一次進行施用,但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選擇適當?shù)膭┝亢?施用方法;而且該些參數(shù)的選擇和優(yōu)化完全在常規(guī)技術(shù)的范圍內(nèi)。制劑的形式?jīng)]有特定的 限制,可W是為通過加入賦形劑(如糖)而粒化的或冷凍干燥的。
[0103] 可加入本發(fā)明的藥劑用于增加殺傷T細胞誘導(dǎo)活性的助劑(auxiliaryagent) 包括;BCG細菌等的菌體組分,包括胞壁酷二膚(MD巧;化化re,vol. 344,p873 (1990)中描 述的ISC0M;J.Immunol,vol. 148,pl438(1992)中描述的皂巧系列(saponinseries)的 QS-21 ;脂質(zhì)體和氨氧化侶等。此外,還可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香茹多糖 (lentinan)、西佐喃(sizofiran)和溶鏈菌(picibanil)作為助劑。還可W使用增強T細 胞的生長和分化的細胞因子等,如比-2、比-4、比-12、比-1、比-6和TNF,W及活化NK-T細 胞的a-半乳糖基神經(jīng)酷胺,W及通過結(jié)合于ToU-樣受體來活化天然免疫系統(tǒng)的脂多糖 (LP巧和CpG,等等,作為助劑。
[0104] 本發(fā)明的疫苗組合物包含引發(fā)殺傷T細胞的組分。脂質(zhì)已被鑒定為用于針對病 毒抗原進行體內(nèi)初次刺激(priming)的物質(zhì)。例如,可將棟桐酸殘基結(jié)合于賴氨酸殘基的 e-氨基和a-氨基,然后與本發(fā)明的免疫原性膚連接。脂質(zhì)化的膚可通過滲入膠束或顆 粒,或封裝入脂質(zhì)體,或在佐劑中乳化來直接施用。脂質(zhì)初次刺激的另一個實例是用大腸桿 菌脂蛋白如S棟桐酷-S-甘油基-半脫氨酷-絲氨酷-絲氨酸(tripalmito^-S-glycery l-cystein}d-se巧l-serine)(P3CSS)當將其共價結(jié)合于合適的膚時進行引發(fā)值eresK., 等,(1989)化Uire:M2:561-4)。
[0105] 本發(fā)明的免疫原性膚可通過病毒載體或細菌載體表達。適當表達載體的實例包括 無毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如,可W使用痘苗病毒作為載 體來表達編碼所述膚的核巧酸序列。將重組牛痘病毒引入宿主細胞,表達出免疫原性膚, 引發(fā)免疫應(yīng)答。也可W使用例如在美國專利No. 4, 722, 848中描述過的使用牛痘載體的免 疫方法。也可W使用卡介苗炬acille化Imette-Guerin)炬CG)。StoverCK等,(1991) 化化re31:456-60中描述了BCG載體。其他多種可用于治療性施用或免疫的載體在本領(lǐng) 域內(nèi)是已知的,該些載體包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒樣桿 菌(傷寒沙口氏菌(Salmonellatyphi))載體和脫毒的炭痘毒素載體。參見,例如,化ata MT等,(2000)M〇1.Med.Today6:66-71;aiedlockDJ和WeinerDB等,(2000)J.Leukoc. Biol. 68:793-806;和Hi卵JD等,(2000)InVivo14:571-85。
[0106] 可通過如下方式在患者體內(nèi)有效地誘導(dǎo)殺傷性T細胞;在體外將抗原膚添加至從 患者收集的細胞或來自另一個與之共有部分HLA等位基因的個體的細胞(同種異體細胞 (allogeneiccell)),并呈遞抗原,然后將該些細胞血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤 處等?;蛘?,通過將膚添加至患者的外周血淋己細胞并在體外培養(yǎng)它們而在體外誘導(dǎo)殺傷T 細胞,而后可將該些細胞可W血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處等。該樣的細胞轉(zhuǎn)移 治療已經(jīng)被實施作為癌癥治療,并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員中熟知的一種方法。
[0107] 本發(fā)明的癌癥類型無特別限制,具體的例子包括食道癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸 癌、膜腺癌、惡性黑素瘤(黑素瘤)、惡性淋己瘤、骨肉瘤、嗜銘細胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢 癌、腦腫瘤、慢性髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、膽 囊癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀脫癌、肉瘤等。適合應(yīng)用本發(fā)明的癌癥的實例包括膽管癌、肺癌、 膜腺癌和膀脫癌。
[010引 做本發(fā)明的抗體
[0109] 本發(fā)明還設(shè)及能夠識別作為表位(抗原)的本發(fā)明上述的膚的一部分或完整的膚 的抗體,并設(shè)及通過使用該蛋白或該膚體外刺激而誘導(dǎo)的殺傷T細胞。通常,殺傷T細胞顯 示出比抗體更強的抗腫瘤活性。
[0110] 此外,與本發(fā)明的膚相似,本發(fā)明抗體可用作針對表達F0XM1的癌癥的預(yù)防劑和/ 或治療劑,只要該些抗體能抑制F0XM1癌癥抗原的活性。在實際應(yīng)用中,本發(fā)明的膚或抗體 可W按原樣施用,或通過與可藥用載體和/或稀釋劑,視需要加上佐劑,一起注射施用?;?者,它們可w通過噴霧方法等經(jīng)粘膜通過透皮吸收施用。更具體地,在本申請中,人血清白 蛋白是載體的實例;而PBS、無菌水等是稀釋劑的實例。
[0111] 本發(fā)明的抗體可W是多克隆抗體或單克隆抗體,并可W用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法來生產(chǎn)。
[0112] 例如,多克隆抗體可通過如下獲得:用本發(fā)明的膚作為抗原免疫哺乳動物或鳥類 物種,并從哺乳動物或鳥類物種收集血液,從收集的血液中分離和純化抗體。例如,可免疫 哺乳動物,如小鼠、倉鼠、豚鼠、家禽(chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊和牛、或鳥類物種。 免疫的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,抗原可例如在例如7到30天的間隔施用2到3次。 劑量可W是,例如,每次施用約0. 05毫克到2毫克的抗原。對施用途徑?jīng)]有特定限制,且可 化合適地選自皮下施用、皮內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用等。此外,抗原可 W在溶解于適當?shù)木彌_液,例如,含常規(guī)的佐劑如弗氏完全佐劑或氨氧化侶的緩沖液后施 用。
[0113] 將經(jīng)免疫的哺乳動物或鳥類物種飼養(yǎng)一段時間后,當抗體效價增加時,可將另外 用例如100微克到1000微克的抗原對它們進行免疫。最后施用后一到兩個月,可從經(jīng)免疫 的哺乳動物或鳥類物種收集血液,血液可W通過常規(guī)方法來分離,來獲得識別本發(fā)明膚的 多克隆抗體作為多克隆抗血清,所述的常規(guī)方法如離屯、、用硫酸錠或聚己二醇沉淀、層析如 凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。
[0114] 在另一方面,單克隆抗體可W通過制備雜交瘤獲得。例如,雜交瘤細胞可W通過將 產(chǎn)生抗體的細胞與骨髓瘤細胞系的細胞融合而獲得。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可 W通過細胞融合方法獲得,如下文所示的方法。
當前第4頁
1 
2 
3 
4 
5 
6