海蜇來源的生物活性肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及從海蜜（化(9仍7細(xì)?<3escu7e/?加?Kishinouye)的蛋白酶解產(chǎn)物中分離 純化具有1個新的生物活性膚，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性膚化iologicallyactivepeptide)是指對生物機(jī)體的生命活動有益或 具有生理作用的膚類化合物。生物活性膚的生物學(xué)意義主要體現(xiàn)在其吸收機(jī)制優(yōu)于氨基 酸和具有氨基酸不可比擬的生理功能兩個方面，其生理功能主要有類嗎啡樣活性、激素和 調(diào)節(jié)激素的作用，對生物體內(nèi)的酶具有調(diào)節(jié)和抑制功能，免疫調(diào)節(jié)，抗血栓，抗高血壓，降低 膽固醇，抑制細(xì)菌、病毒，抗癌等作用，抗氧化和清除自由基作用，改善元素吸收和礦物質(zhì)運(yùn) 輸，促進(jìn)生長，調(diào)節(jié)食品風(fēng)味、口味和硬度等。因此，生物活性膚是藥物篩選、制備疫苗和食 品添加劑的天然資源寶庫。
[0003]海蜜（化(9仍7e曲<3 曲Kishinouye)屬于根口水母目（化曲eae)，腔 腸動物，作為一種藥食同源的大型水母，在我國有廣闊的資源分布和悠久的應(yīng)用歷史，早在 一千六百多年前就已經(jīng)開始為世人所食用。海蜜除食用外，全身均可入藥，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為 其性味咸平，入肺、肝兩經(jīng)，有潤肺、化疲、止咳、清熱、消食、潤腸等功效。據(jù)李時珍《本草綱 目》所述，海蜜"氣味咸溫?zé)o毒、主治婦，入勞損、積血帶下，小兒風(fēng)疾丹毒，燙火傷"等，對氣 管炎、哮喘、高血壓、胃潰瘍、單純性甲狀腺腫大等癥均有療效。近年來我國醫(yī)衛(wèi)部口關(guān)于海 蜜的藥用價值也有許多報道。認(rèn)為對治療高血壓、慢性氣管炎、哮喘、熱?？人?、胃潰瘍，單 純性甲狀腺腫和頸淋己結(jié)腫等，有一定療效。尤其是海蜜的降壓作用比較顯著，藥理研究證 明；海蜜蛋白酶解產(chǎn)物對腎動脈狹窄高血壓模型動物具有明顯的降壓作用。海蜜主要是由 水，蛋白質(zhì)、灰分、碳水化合物、脂肪等物質(zhì)組成。近代研究分析表明：每100g海蜜食部中， 含水分65.0g，灰分18. 7g，蛋白質(zhì)12. 3g，碳水化合物3.9g，脂肪0. 1g，巧182mg，鐵 9. 5mg，硫胺素0.01mg，核黃素0.04mg，巧克酸0.2mg，膽固醇16mg。海蜜的許多藥理 活性都與其所含蛋白有關(guān)，由此推測海蜜的蛋白酶解產(chǎn)物中可能存在一定數(shù)量的生物活性 膚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種海蜜來源的生物活性膚的制備方法。
[0005] 本發(fā)明從海蜜蛋白的酶解產(chǎn)物中分離純化出1個新的生物活性膚，其序列分別為 Val-Gly-Pro-Tyr，藥理學(xué)活性研究顯示其體外具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（AC巧抑制 活性，其ICs。為8. 40 + 0. 58uM，但不限于此； 1.海蜜蛋白酶解產(chǎn)物的制備 將=孤海蜜洗凈除去泥沙等雜質(zhì)，切塊，加入10倍量水，浸泡5-6小時，用清水洗漆 后，重復(fù)上述操作S次，漸干后加適量水打漿，加水至10倍量，加入4% (W底物蛋白含量 計，w/w%)海產(chǎn)品水解專用酶（南寧東恒華道生物科技有限公司）調(diào)整抑至8. 0,溫度55°C 水解4. 5h，100°C加熱10min滅酶后，4000轉(zhuǎn)/分離屯、15min,取上清液。
[0006] 采用分子量為5000化的超濾膜對上清液進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于5000Da 的部分，再進(jìn)行納濾處理脫鹽，納濾條件；分子量為150-300截留膜，進(jìn)膜壓力llBar，出 膜壓力llBar。截留液進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥條件；溫度控制條件；0-50min，(TC升至 20。[;50-300 111111，20。[;300-350 111111，20。[升至40。[;350- 750 111111，40。[;750-800 min，4(TC降至20°C;真空度為40pa，溫度-30°C，最終得到海蜜蛋白酶解產(chǎn)物。
[0007] 2.生物活性膚的分離純化 2. 1Se地adexLH-20凝膠色譜柱層析 取1中海蜜蛋白酶解產(chǎn)物蒸饋水溶解成200mg/ml溶液，Sephadex LH-20凝膠色譜柱 (2. 0cmX60cm)進(jìn)行分離純化，流動相為蒸饋水，洗脫速度為0.6ml/min，220皿測定吸 光度，收集各峰，凍干備用。
[0008]2.2高效液相色譜的分離純化 用高效液相色譜進(jìn)一步分離純化。色譜條件如下；色譜柱為反相C18鍵合硅膠柱(WatersAtlantis,T3, 250mmX4.6mm, 5ym);流動相；A水，B己膳，梯度洗脫條件見 下表1。流速；1.0ml/min，柱溫30°C，檢測波長為220皿和280皿。收集主要色譜峰，凍 干備用得到短膚樣品。
[0009] 表1高效液相色譜分離條件
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海蜇來源的生物活性肽，其特征是具有如下序列的短肽：Val-Gly-Pro-Tyr。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海蜇來源的生物活性肽的制備方法，其特征是它包括 如下步驟：（1)海蜇蛋白酶解產(chǎn)物的制備；海蜇用海產(chǎn)品水解專用酶酶解，經(jīng)超濾和納濾 脫鹽凍干得海蜇蛋白酶解產(chǎn)物；（2)生物活性肽的分離純化；將海蜇蛋白酶解產(chǎn)物采用 SephadexLH-20凝膠色譜柱層析，高效液相色譜分離純化得到一個新的四肽，體外活性顯 示其具有較好的ACE抑制活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述，其特征是所述海蜇蛋白酶解產(chǎn)物的制備包括如下步驟：將三 礬海蜇洗凈除去泥沙等雜質(zhì)，切塊，加入10倍量水，浸泡5- 6小時，用清水洗滌后，重復(fù)上 述操作三次，瀝干后加適量水打漿，加水至10倍量，加入4% (以底物蛋白含量計，w/w%)海 產(chǎn)品水解專用酶（南寧東恒華道生物科技有限公司）調(diào)整PH至8.0,溫度55°C水解4.5h， 100°C加熱10min滅酶后，4000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清液； 采用分子量為5000Da的超濾膜對上清液進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于5000Da的 部分，再進(jìn)行納濾處理脫鹽，納濾條件：分子量為150 - 300截留膜，進(jìn)膜壓力11Bar，出 膜壓力11Bar;截留液進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥條件：溫度控制條件：0 - 50min，0°C升至 20°C;50 - 300min，20°C;300 - 350min，20°C升至 40°C;350 - 750min，40°C;750 - 800 min，40°C降至20°C;真空度為40pa，溫度-30°C，最終得到海蜇蛋白酶解產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種海蜇來源的生物活性肽的制備方法，其特征是生物活性 肽的分離純化包括如下步驟： (1) SephadexLH-20凝膠色譜柱層析； 取海蜇蛋白酶解產(chǎn)物用蒸餾水溶解成200mg/ml溶液，S印hadexLH-20凝膠色譜柱2. 0cmX60cm進(jìn)行分離純化，流動相為蒸餾水，洗脫速度為0.6ml/min，220nm測定吸光度，收 集各峰，凍干備用； (2) 高效液相色譜的分離純化； 用高效液相色譜進(jìn)一步分離純化； 色譜條件如下：色譜柱為反相C18鍵合硅膠柱（WatersAtlantis,T3, 250mmX4. 6mm, 5ym);流動相：A水，B乙腈，梯度洗脫條件見下表1;流速：1.0ml/min，柱溫30°C，檢 測波長為220nm和280nm，收集主要色譜峰，凍干備用得到短肽樣品。
【專利摘要】一種海蜇來源的生物活性肽及其制備方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從海蜇的蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化制備得到1個新的含有4個氨基酸序列的短肽，其序列鑒定為Val-Gly-Pro-Tyr，體外活性顯示具有較好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性。本發(fā)明旨在為海蜇資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。
【IPC分類】A61P35-00, C07K1-20, C07K14-47, C12P21-06, C07K1-34, A61K38-17, C07K1-36
【公開號】CN104774255
【申請?zhí)枴緾N201510174322
【發(fā)明人】劉新, 張綿松, 楊子君, 袁文鵬, 夏雪奎, 張永剛, 賈愛榮, 史亞萍, 齊君, 喬若瑾, 唐煒, 劉昌衡
【申請人】山東省科學(xué)院生物研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月14日