專利名稱：Clk－肽和slk－肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及使用包含變性膠原IV型的選擇性拮抗物的活性劑，來(lái)抑制或檢測(cè)血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法和組合物。
背景技術(shù)：
腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移每年影響許多人。據(jù)估計(jì)美國(guó)每年確診超過(guò)600,000例癌癥的新病例(Varner，J.，等人，Cell Adh.Commun.1995；3367-374)。
轉(zhuǎn)移，即惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤群向遠(yuǎn)距離部位的擴(kuò)散，涉及一系列復(fù)雜的互相聯(lián)系的事件。(Liotta，等人，Cell 1991；64327-336；Wyckoff，等人，.Cancer Res.2000；602504-2511；Kurschat，等人，Clinc.Exp.Dermatol.2000；25482-489.)轉(zhuǎn)移的級(jí)聯(lián)始于導(dǎo)致細(xì)胞間相互作用變化的一系列遺傳改變，其允許腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤群分離開(kāi)來(lái)。分離的細(xì)胞局部地侵襲并遷移通過(guò)蛋白水解修飾的胞外基質(zhì)(ECM)。該分離的細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。為了形成轉(zhuǎn)移沉積，循環(huán)的腫瘤細(xì)胞必須逃避宿主的免疫防御、微脈管系統(tǒng)的捕獲，并避免從循環(huán)中溢出。腫瘤細(xì)胞然后在新的部位侵襲ECM，增殖，誘導(dǎo)血管發(fā)生，并繼續(xù)生長(zhǎng)。
設(shè)計(jì)用于阻斷血管發(fā)生的治療可以顯著地影響實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在不同的動(dòng)物模型中阻斷腫瘤新血管形成能顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，而且人類臨床數(shù)據(jù)也開(kāi)始支持這一論點(diǎn)(Varner，J.，等人，Cell Adh.Commun.1995；3367-374)。這些以及其它的研究表明，實(shí)體瘤的生長(zhǎng)需要新血管生長(zhǎng)用于腫瘤的繼續(xù)擴(kuò)展以超過(guò)最小大小(Varner等人，1995；Blood，C.H.，等人，Biochim.Biophys.Acta.1990；103289-118；Weidner，N.等人J Natl.Cancer Inst.1992；841875-1887；Weidner，N.等人，N.Engl.J Med.1991；3241-7；Brooks，P.C.等人J Clin.Invest.1995；961815-1822；Brooks，P.C.等人，Cell 1994；791157-1164；Brooks，P.C.等人Cell1996；85683-693；Brooks，P.C.等人，Cell 1998；92391-400).血管發(fā)生的抑制因此是癌癥和轉(zhuǎn)移性疾病的一種有希望的療法。
血管發(fā)生是通過(guò)該生理過(guò)程從已存在的血管產(chǎn)生新血管的生理過(guò)程(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992)。這種復(fù)雜過(guò)程需要包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附受體、基質(zhì)降解酶和胞外基質(zhì)成分在內(nèi)的多種分子的協(xié)作(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992)。
血管發(fā)生的抑制還可用于治療其特征在于無(wú)限制的血管發(fā)生的其他疾病，包括，例如，眼睛疾病(例如，黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病)和炎性疾病(例如，關(guān)節(jié)炎和牛皮癬)(Varner等人，1995)。
許多研究者已經(jīng)把他們的抗血管生成方法集中在能啟動(dòng)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子上(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992；Weidner等人，1991；Brooks等人，1995；Brooks等人，1994；Brooks等人，1997)。然而，有許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子具有刺激血管發(fā)生的能力。因此，由于這種豐余性，阻斷單個(gè)細(xì)胞因子的治療可能只有有限的好處。很少關(guān)注其他的抗血管生成靶。
最近的研究表明，血管發(fā)生需要血管周圍胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白水解重建，以提供有助于新血管發(fā)生的微環(huán)境(Varner等人(1995)；Blood等人(1990)；Weidner等人(1992)；Weidner等人(1991)；Brooks等人(1995)；Brooks等人(1994)；Brooks等人(1997))。胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)膠原占動(dòng)物中總蛋白質(zhì)量的25％以上，并且是ECM內(nèi)的占多數(shù)的蛋白質(zhì)。
抑制血管發(fā)生是一種限制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的有用療法。血管發(fā)生的抑制將受到下述因素的影響(1)“生血管分子”例如bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)釋放的抑制，(2)生血管分子的中和，(例如，抗-bFGF抗體)，和(3)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生血管刺激應(yīng)答的抑制。(Folkman等人，Cancer Biology，389-96(1992))。已經(jīng)描述了幾種可能的內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答抑制劑可用于抑制血管發(fā)生，例如，膠原酶抑制劑、基底膜更新抑制劑、血管抑制類固醇(angiostatic steroids)、真菌來(lái)源的血管發(fā)生抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)炎藥物例如D-青霉胺和硫代蘋果酸金、維生素D3類似物、α-干擾素。文獻(xiàn)中還描述了另外的建議的血管發(fā)生抑制劑。(Blood，等人(1990)；Moses等人(1990)Science2481408-1410；Ingber，等人(1988)Lab.Invest.，5944-51；和美國(guó)專利Nos.5,092,885；5,112,946；5,192,744；和5,202,352.)膠原是包含[Gly-Xaa-Xaal]n基序的胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。膠原的類型是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)，例如，Olsen，B.R.(1995)Curr.Op.Cell.Biol.5720-727；Kucharz，E.J.The CollagensBiochemistry and Pathophysiology.Springer-Verlag，Berlin，1992；Kunn，K.in Structure and Function ofCollagen Types，eds.R.Mayne and R.E.Burgeson，Academic Press，Orlando).膠原是以多種形式存在的纖維性多鏈三股螺旋蛋白質(zhì)(Olsen，B.R.(1995)Curr.Opin.Cell Biol 7，720-727；Van der Rest，M.，等人(1991)FASEB 5，2814-2823).已經(jīng)鑒定了至少18種在遺傳學(xué)上不同的膠原類型，其中很多具有不同的組織分布與功能(Olsen(1995)；Van der Rest，等人(1991))。膠原I型是胞外基質(zhì)中最豐富的膠原。膠原I型膠原III型、膠原IV型和膠原V型已經(jīng)顯示與體內(nèi)所有預(yù)先存在的血管相關(guān)。
成熟的膠原分子由扭轉(zhuǎn)成三股螺旋的2個(gè)α1和1個(gè)α2鏈組成。膠原I型和IV型，例如，分別由命名為α1(I)和α2(I)與α1(IV)和α2(IV)的主鏈組成。在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)膠原通常以成熟的三股螺旋形式存在。
成熟三股螺旋膠原的天然三維結(jié)構(gòu)的變性可暴露隱蔽的控制血管發(fā)生的調(diào)節(jié)區(qū)。用抗體破壞細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用可阻斷腫瘤生長(zhǎng)和血管發(fā)生(Xu，J.，等人(2001)J.Cell Biol.Vol.1541069-1079；Hangia，等人(2002)Am.J.Pathol.Vol.1611429-1437)。Brooks等人(PCT WO 00/40597)公開(kāi)了能與不同的變性膠原類型內(nèi)的隱蔽區(qū)域結(jié)合的抗體。
目前意外地發(fā)現(xiàn)，選擇用于變性膠原IV型的肽拮抗物能抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)?？商禺愋越Y(jié)合變性膠原IV型的肽拮抗物為治療癌癥、炎性疾病及其他血管發(fā)生相關(guān)疾病的有效的新化合物提供了基礎(chǔ)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物施用包含血管發(fā)生抑制量的變性膠原IV型選擇性拮抗物的活性劑，來(lái)抑制哺乳動(dòng)物組織中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物施用包含腫瘤細(xì)胞粘著抑制量的變性膠原IV型選擇性拮抗物的活性劑，來(lái)抑制哺乳動(dòng)物組織中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明還提供了可特異性結(jié)合變性膠原IV型，并可用于抑制哺乳動(dòng)物中血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的肽拮抗物。更具體地，本發(fā)明提供了包含能抑制血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的變性膠原IV型選擇性拮抗物的生物活性劑。本發(fā)明肽拮抗物與變性膠原IV型的結(jié)合親和力大大高于該拮抗物與天然形式的膠原IV型的結(jié)合親和力。
用于本發(fā)明的變性膠原IV型選擇性拮抗物具有核心氨基酸序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
用于本發(fā)明的一種優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH的肽(CLK-肽)。
用于本發(fā)明的另一種優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH的肽(SLK肽)。
用于本發(fā)明的另一種優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-A-COOH的肽(KGGCLK肽)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，變性膠原IV選擇性拮抗物與細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑偶聯(lián)。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)把組織暴露給可檢測(cè)標(biāo)記的變性膠原IV型選擇性拮抗物，來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織中血管發(fā)生的方法。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種方法，該方法通過(guò)把待測(cè)組織暴露給可檢測(cè)標(biāo)記的變性膠原IV型選擇性拮抗物，來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織中的腫瘤組織、轉(zhuǎn)移、腫瘤侵入、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎、炎癥或特征在于膠原IV型變性或與膠原IV型變性相關(guān)的其他任何疾病或狀態(tài)(condition)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了M21人類黑素瘤細(xì)胞向未經(jīng)處理的變性IV型膠原(NT)、CLK-肽處理的變性膠原IV型、SLK-肽處理的變性膠原IV型和SDR-肽處理的變性膠原IV型上的粘附。
圖2顯示了B16鼠黑素瘤細(xì)胞向未經(jīng)處理的變性膠原IV型(NT)、CLK-肽處理的變性膠原IV型和SHR-肽處理的變性膠原IV型上的粘附。
圖3(a)，(b)和(c)分別顯示了沒(méi)有bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的雞尿囊絨膜(CAM)，bFGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生之后的CAM，以及bFGF-誘導(dǎo)血管發(fā)生之后用CLK-肽處理的CAM。
圖4顯示了兩組CAM生血管的血管的定量，其中一組經(jīng)bFGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，但隨后未進(jìn)行CLK-肽處理，，另一組經(jīng)bFGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，并隨后進(jìn)行CLK-肽處理。
圖5顯示了未用CLK-肽處理的雞胚肺(NT)與用CLK-肽處理的雞胚肺上的B16黑素瘤轉(zhuǎn)移的定量。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎、炎癥或特征在于膠原IV型變性或與膠原IV型變性相關(guān)的其他任何疾病或狀態(tài)的組合物和方法，以及用于通過(guò)使用變性膠原IV型選擇性拮抗物檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎、炎癥或特征在于膠原IV型變性或與膠原IV型變性相關(guān)的其他任何疾病或狀態(tài)的組合物和方法。具有氨基酸核心L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L的肽選擇性結(jié)合變性的膠原IV型。
本發(fā)明的方法提供了抑制形成與維持癌細(xì)胞所需的新血管形成的生物活性劑。另外，本發(fā)明還提供了直接抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、炎癥及其他與細(xì)胞與變性膠原IV型間相互作用相關(guān)的疾病或狀態(tài)的方法和組合物。本發(fā)明的活性劑選擇性結(jié)合變性的膠原IV型，從而防止血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、炎性疾病及其他與細(xì)胞與這種膠原的相互作用相關(guān)的疾病或狀態(tài)。
定義如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“血管發(fā)生”包括涉及組織的新血管形成的多個(gè)過(guò)程，包括“萌發(fā)”、血管發(fā)生或血管增大。所有的血管發(fā)生過(guò)程都涉及血管中胞外基質(zhì)膠原的破壞。在創(chuàng)傷的傷口愈合、黃體形成和胚胎發(fā)生期間發(fā)生的血管發(fā)生是正常生理學(xué)的一部分。然而大多數(shù)血管發(fā)生情況與疾病過(guò)程相關(guān)。
如這里使用的，“拮抗物”指抑制天然存在的生物活性的化合物。
如這里使用的，膠原內(nèi)的“隱蔽表位”是在天然膠原內(nèi)不被暴露識(shí)別，但是能夠被變性膠原的拮抗物識(shí)別的序列。在天然結(jié)構(gòu)中不暴露于溶劑或僅僅部分暴露于溶劑的肽序列是可能的隱蔽表位。隱蔽表位的序列可以通過(guò)測(cè)定拮抗物的特異性來(lái)鑒定。還可以例如通過(guò)檢驗(yàn)天然的三股螺旋膠原的三維結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定候選的隱蔽表位。
如這里使用的，“天然膠原”指主要以三股螺旋形式存在的膠原。
如這里使用的，“變性膠原”指不再主要以天然的三股螺旋形式存在的膠原。變性膠原可以是變性的全長(zhǎng)膠原或膠原的片段。膠原的片段可以是短于全長(zhǎng)膠原序列的任何膠原序列。對(duì)于具有基本天然結(jié)構(gòu)的膠原的片段，可以象天然的全長(zhǎng)膠原一樣實(shí)現(xiàn)變性。片段還可以具有一定的大小，從而使其不具有顯著的天然結(jié)構(gòu)或具有沒(méi)有顯著的天然三股螺旋形式的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“變性膠原”包括“蛋白水解的膠原”。“蛋白水解的膠原”指通過(guò)蛋白水解酶的作用而結(jié)構(gòu)上改變的膠原。
如這里使用的，“變性膠原IV型選擇性拮抗物”是與變性膠原IV型的結(jié)合親和力大大高于與天然膠原IV型的結(jié)合親和力的物質(zhì)。
如這里使用的，“表位”是能被本發(fā)明的拮抗物識(shí)別的氨基酸序列。表位可以是線性的肽序列或可以由不連續(xù)的氨基酸序列組成。一種拮抗物可以識(shí)別一個(gè)或多個(gè)序列，因此一個(gè)表位可以限定一個(gè)以上的不同氨基酸序列靶標(biāo)。拮抗物識(shí)別的表位可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽作圖和序列分析技術(shù)來(lái)確定。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“肽”指一系列兩個(gè)或更多共價(jià)連接的氨基酸。線性的、環(huán)狀的或分枝的肽都可用于實(shí)施本發(fā)明。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“核心氨基酸序列”指可始于肽的N-末端，可以是肽的內(nèi)部序列，或者可止于肽的C-末端的氨基酸序列。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“擬肽”用于指模擬肽的活性的化合物。擬肽不是肽，但是可包含通過(guò)非肽鍵連接的氨基酸。在一種擬肽中，與隱蔽的三維結(jié)構(gòu)特異性相互作用的肽的三維結(jié)構(gòu)被一種非肽分子復(fù)制。
如這里使用的“新血管形成”指新血管的發(fā)生。新血管形成可指血管發(fā)生的過(guò)程和/或血管發(fā)生的結(jié)果，其為新血管形成。
如這里定義的，“患者”是需要治療生血管疾病、腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的任何哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的患者包括農(nóng)業(yè)上的或馴養(yǎng)的哺乳動(dòng)物；例如豬、母牛、馬、山羊、綿羊、騾、驢、狗、貓、兔、小鼠和大鼠。尤其優(yōu)選的患者是人類。
短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指“通常被認(rèn)為是安全的”分子實(shí)體和組合物，例如，當(dāng)施用給人類時(shí)，在生理學(xué)上可耐受，并且一般不產(chǎn)生變應(yīng)性反應(yīng)或類似的不良反應(yīng)，例如胃不適、頭暈等等。優(yōu)選地，如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國(guó)藥典或其他公認(rèn)的藥典中列出的，用于動(dòng)物，更特別地用于人類。術(shù)語(yǔ)“載體”指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這些藥用載體可以是無(wú)菌的液體，例如水和油類，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油類，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。水或水溶液、鹽溶液和含水右旋糖以及甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別地用于可注射的溶液。E.W.Martin在《Remington藥物科學(xué))》中描述了合適的藥用載體。
“大大提高的親和力”指靶化合物的結(jié)合親和力比標(biāo)準(zhǔn)化合物高至少1.5倍，更優(yōu)選至少高10倍，最優(yōu)選至少高100倍。選擇性拮抗物對(duì)于變性膠原IV型(靶化合物)是特異的，而且比較了該選擇性拮抗物與天然膠原(標(biāo)準(zhǔn)化合物)的結(jié)合親和力。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他技術(shù)，例如，表面等離振子共振技術(shù)(在BIOCORE 2000系統(tǒng)上進(jìn)行分析)(Liljeblad，等人(2000)Glyco.J.，Vol.17323-329)，和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量以及傳統(tǒng)的結(jié)合分析(Heeley，R.P.(2002)Endocr.Res.，Vol.28217-229)，可進(jìn)行表觀結(jié)合親和力測(cè)量。
“治療有效量”指足以在被處理的組織中產(chǎn)生可測(cè)量的血管發(fā)生減少的選擇性變性膠原拮抗物的量，也即，抑制血管發(fā)生的量；或足以產(chǎn)生可測(cè)量的腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、炎性疾病或與變性膠原IV型有關(guān)的疾病減少的選擇性變性膠原拮抗物的量。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“治療”指，施用變性膠原IV型的選擇性拮抗物來(lái)預(yù)防血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎、炎癥或特征在于膠原IV型變性或與膠原IV型變性相關(guān)的其它任何疾病或狀態(tài)，或者抑制患有這種疾病或狀態(tài)的患者中已存在的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎、炎癥或特征在于膠原IV型變性或與膠原IV型變性相關(guān)的其它任何疾病或狀態(tài)的進(jìn)展，和/或改善與這種疾病或狀態(tài)相關(guān)的癥狀。
術(shù)語(yǔ)“單位劑量”當(dāng)用于本發(fā)明的治療組合物時(shí)，指適合作為用于個(gè)體的單次劑量的物理學(xué)上離散的單元，每個(gè)單位包含預(yù)先確定的量的活性物質(zhì)，經(jīng)計(jì)算其單獨(dú)或在含有適當(dāng)稀釋劑、載體(carrier)、載體(vehicle)或其他賦形劑的組合物中產(chǎn)生所需的治療效果。
變性膠原IV型拮抗物本發(fā)明的生物活性劑包含對(duì)變性膠原IV型具有強(qiáng)結(jié)合親和力的化合物。本發(fā)明的變性膠原IV型選擇性拮抗物具有氨基酸核心序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
一種優(yōu)選用于本發(fā)明的變性膠原IV型選擇性拮抗物為CLK-肽。CLK-肽高特異性地結(jié)合變性的膠原IV型。CLK肽的氨基酸序列為NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH。CLK-肽與變性膠原IV型內(nèi)的區(qū)域結(jié)合，并抑制細(xì)胞與變性膠原IV型間的相互作用。粘著細(xì)胞與胞外基質(zhì)內(nèi)功能性表位的相互作用具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。(Xu，J.，等人(2001)J.Cell Biol.Vol.1541069-1079；Hangia，等人(2002)Am.J.Pathol.Vol.1611429-1437)。CLK-肽顯示有效地阻斷體內(nèi)的血管發(fā)生(下面的實(shí)施例4)和腫瘤生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移(下面的另一種優(yōu)選用于本發(fā)明的選擇性變性膠原IV型拮抗物為SLK-肽。SLK-肽高特異性地結(jié)合變性的膠原IV型，并抑制細(xì)胞與變性膠原IV型間的相互作用。SLK-肽的氨基酸序列為NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH。
另一種優(yōu)選用于本發(fā)明的選擇性變性膠原IV型拮抗物為KGGCLK肽。KGGCLK肽高特異性地結(jié)合變性的膠原IV型，并抑制細(xì)胞與變性的膠原IV型間的相互作用。KGGCLK肽的氨基酸序列為NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-COOH。
例如，連續(xù)固相結(jié)合測(cè)定可用于鑒定變性膠原IV型選擇性拮抗物。鑒定變性膠原IV型拮抗物的優(yōu)選方法為扣除免疫(Xu，J.等人(2000)Hybridoma，Vol.19375-385)和扣除噬菌體展示(實(shí)施例1)(Amstutz P.，等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.，vol.12400-405)。
一種優(yōu)選的變性方法為熱變性，因?yàn)闊嶙冃援a(chǎn)生較少在體內(nèi)具有極低免疫原性的小片段。膠原IV型可以通過(guò)例如加熱膠原IV型到100℃保持15分鐘來(lái)進(jìn)行熱變性。變性還可以通過(guò)用離液劑處理膠原來(lái)完成。合適的離液劑包括，例如，胍鹽。膠原還可以通過(guò)電離輻射、非電離輻射(紫外線)、熱損傷和機(jī)械應(yīng)力或機(jī)械力來(lái)進(jìn)行變性。膠原可以通過(guò)蛋白水解作用進(jìn)行變性。特別地，可以通過(guò)用金屬蛋白酶例如MMP-1、MMP-2或MMP-9處理膠原，或通過(guò)用包含膠原降解活性的細(xì)胞提取物處理膠原，來(lái)制備蛋白水解的膠原。蛋白水解的膠原還可能天然存在于組織中的新血管形成、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)菌侵入、關(guān)節(jié)炎和炎癥部位。
例如，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)例如吸光度、圓二色性或熒光的光譜改變，通過(guò)核磁共振，通過(guò)拉曼光譜測(cè)定法，或通過(guò)任何其他的適用技術(shù)，來(lái)監(jiān)測(cè)膠原的變性。
得到的變性膠原IV型片段然后可固定到固體基質(zhì)上。已知結(jié)合膠原的肽可以獲自肽文庫(kù)。(Amstutz P.，等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.，vol.12400-405)。膠原-結(jié)合肽可以通過(guò)該固體基質(zhì)。結(jié)合變性膠原IV型的肽粘附于該固體基質(zhì)上。粘附的肽然后從該固體基質(zhì)上洗下，并通過(guò)固定有天然膠原IV型的第二個(gè)固體基質(zhì)。不與第二個(gè)固體基質(zhì)結(jié)合的肽為變性膠原IV型選擇性拮抗物。
用于本發(fā)明的選擇性肽與多肽拮抗物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的幾種不同的技術(shù)來(lái)制備。例如，雙雜交系統(tǒng)(例如，F(xiàn)ields，S.(1989)Nature 340245-6)使用膠原片段作為“餌”用于從與膠原肽結(jié)合的文庫(kù)中篩選蛋白質(zhì)拮抗物。該系統(tǒng)及其操作描述于Green，D.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1001010-1015(2003)與Gyuris，J.等人(1993)Cell，Vol.75791-803中。可能的拮抗物的文庫(kù)可以源自于例如cDNA文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可能的拮抗物可以是已知膠原結(jié)合蛋白質(zhì)例如整聯(lián)蛋白與纖連蛋白的變體。(Hynes，R.O.(1992)Cell，Vol.6911-25；Steffensen，B.，等人(2002)Matrix Biol.，Vol.21399-414；Ingham，K.C.，等人(2002)Arch.Biochem.Biophys.，Vol.407217-223)。這些蛋白質(zhì)可以進(jìn)行隨機(jī)誘變處理或經(jīng)受基因改組，或其它用于產(chǎn)生序列多樣性的熟知技術(shù)(Tani，P.H.，等人(2002)Biochm.J.，Vol.365287-294；Stephanopoulos，G.(2002)Nat.Biotechnol.，Vol.20666-668)。
本發(fā)明的肽拮抗物還可以使用Zhao，H.等人(2002)Cur.Opin.Biotechnol.，Vol.13104-110與Guo，Z.，等人(2002)Biochemistry，Vol.4110603-10607中所述的分子進(jìn)化技術(shù)產(chǎn)生。蛋白質(zhì)文庫(kù)可以通過(guò)誘變、基因改組或其他用于產(chǎn)生分子多樣性的熟知技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。例如，可以通過(guò)使代表許多變體的蛋白質(zhì)庫(kù)(pool)通過(guò)附著有變性膠原質(zhì)的固體基質(zhì)，來(lái)根據(jù)其結(jié)合變性膠原的能力篩選這種蛋白質(zhì)庫(kù)。用鹽梯度進(jìn)行洗脫，例如，可以提供與變性膠原具有親和力的變體的純化。還可以包括使該庫(kù)通過(guò)附著有天然膠原的固體基質(zhì)的負(fù)選擇步驟。濾液包含該庫(kù)中與天然形式的膠原的親和力降低的那些變體。
本發(fā)明的肽與多肽拮抗物還可以通過(guò)噬菌體展示產(chǎn)生。噬菌體展示是一種其中肽表達(dá)為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白的篩選技術(shù)。結(jié)果是融合蛋白展示在病毒體表面，編碼融合蛋白的DNA位于病毒體內(nèi)。(Smith G.P.(1985)Filamentous fusion phageNovel expressionvectors that display cloned antigens on the viron surface.Science.2281315-1317；Smith G.P.，等人(1993)Libraries of peptides and proteins displayedon filamentous phage.Methods Enzymol.217228-257)。噬菌體展示可以使用稱為淘選的體外方法迅速鑒定多種靶分子的肽配體。例如，如下進(jìn)行淘選將噬菌體展示的肽文庫(kù)與用靶包被的微量滴定板一起孵育，洗掉未結(jié)合的噬菌體，并洗脫結(jié)合的噬菌體。洗脫的噬菌體然后擴(kuò)增，并通過(guò)另外的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)以富集有利于結(jié)合序列的庫(kù)。3-4輪淘選之后，通過(guò)DNA測(cè)序鑒定單個(gè)克隆。
隨機(jī)化的肽或蛋白質(zhì)可以作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白表達(dá)于噬菌粒(該術(shù)語(yǔ)表示噬菌體和質(zhì)粒的組合)顆粒表面。單價(jià)噬菌體展示技術(shù)是廣泛可用的(參加，例如，Lowman H.B.等人(1991)Biochemistry 3010832-8.)。表達(dá)隨機(jī)化肽或蛋白質(zhì)文庫(kù)的噬菌體可以用附著有天然膠原分子的固體基質(zhì)進(jìn)行淘選。剩余的噬菌體不與天然膠原結(jié)合，或者以大大降低的親和力與天然膠原結(jié)合。然后用附著有變性膠原的固體基質(zhì)淘選噬菌體。通過(guò)溶液條件的改變，或者對(duì)于適當(dāng)設(shè)計(jì)的構(gòu)建體，通過(guò)蛋白水解裂解連接噬菌體外殼蛋白與隨機(jī)化肽或蛋白質(zhì)文庫(kù)的接頭區(qū)，來(lái)從固體基質(zhì)上分離結(jié)合的噬菌體?？梢詫?duì)分離的噬菌體進(jìn)行測(cè)序以確定選擇的拮抗物的身份。
熟知的ELISA檢測(cè)可用于鑒定用于實(shí)施本發(fā)明的膠原IV型的選擇性拮抗物。
使用固相ELISA來(lái)測(cè)定肽或多肽是否能結(jié)合變性的或天然的膠原，可以鑒定作為拮抗物的肽或多肽。ELISA測(cè)定可與多種膠原類型一起使用；例如，ELISA測(cè)定可與膠原I、II、III、IV和V型一起使用，以及用于其他的胞外基質(zhì)組分。結(jié)合親和力的水平可以通過(guò)表面等離振子共振技術(shù)(在BIOCORE 2000系統(tǒng)上進(jìn)行分析)(Liljeblad，等人(2000)Glyco.J.，vol.17323-329)和通過(guò)傳統(tǒng)斯卡查德結(jié)合分析的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量(Heeley，R.P.(2002)Endocr.Res.，Vol.28217-229)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
固相ELISA還可用于鑒定顯示對(duì)變性形式的膠原的特異性，而對(duì)天然膠原無(wú)特異性的化合物。通過(guò)進(jìn)行平行ELISA進(jìn)行特異性測(cè)定，其中在分離的測(cè)定室中根據(jù)結(jié)合變性與天然膠原的能力同時(shí)篩選可能的拮抗物。
拮抗物還可以根據(jù)它們結(jié)合包含變性膠原的固體基質(zhì)的能力來(lái)進(jìn)行鑒定。在改變?nèi)芤簵l件如鹽濃度、pH、溫度等之后收集假定的拮抗物。該假定的拮抗物可根據(jù)它們?cè)谶m當(dāng)?shù)娜芤簵l件下通過(guò)附著有天然膠原的固體基質(zhì)的能力來(lái)進(jìn)一步鑒定。
本發(fā)明的拮抗物可與來(lái)自任何無(wú)脊椎動(dòng)物或包括人類在內(nèi)的任何脊椎動(dòng)物的膠原IV型分子一起使用。在Engel，J.(1997)Science，Vol.2771785-1786和Gordon，M.K.，等人(1990)Curr.Opin.Cell Biol.，Vol.2833-838中可見(jiàn)膠原IV型分子的實(shí)例。優(yōu)選地，所述膠原IV型是哺乳動(dòng)物膠原IV型。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是豬、母牛、山羊、兔、小鼠、大鼠、狗、貓、綿羊、驢、馬或騾。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，膠原是人膠原IV型。
本發(fā)明中使用的活性劑包含一種或多種變性膠原IV型拮抗物。變性膠原IV型的拮抗物可以是與變性膠原IV型的結(jié)合親和力大大高于與天然形式的膠原IV型的結(jié)合親和力的任何肽、多肽或擬肽。
本發(fā)明的肽拮抗物可以通過(guò)例如磷酸化作用、羥基化作用或甲基化作用進(jìn)行修飾?？稍鰪?qiáng)活性的另外的修飾包括肽環(huán)化和肽穩(wěn)定化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括這里顯示了其氨基酸殘基序列的多肽的類似物、片段或化學(xué)衍生物，只要該肽是變性膠原IV型的拮抗物而不是天然膠原的拮抗物。因此，肽可以進(jìn)行多種變化、取代、插入和缺失，其中這些變化在使用中提供了某些優(yōu)點(diǎn)。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的變性膠原IV型拮抗物肽包括所述肽的序列，其中對(duì)該肽進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)序列變化，而且在此處所述的一種或多種檢測(cè)中，該肽保持用作變性膠原IV型選擇性拮抗物的能力。
KGGCLK-肽是一種這樣修飾的肽，KGGCLK-肽是具有添加到N-末端的序列KGG與添加到C-末端的GKA的CLK-肽。氨基酸的偶聯(lián)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)完成，例如，提供于Stewart和Young，1984，固相合成，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL。
拮抗物可以與細(xì)胞毒素例如順鉑、長(zhǎng)春花堿和吉西他濱偶聯(lián)，用于輸送到正經(jīng)受血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎或與細(xì)胞與變性膠原IV型間相互作用相關(guān)的其他疾病或狀態(tài)的腫瘤或其他組織中?？梢杂萌芗?xì)胞素或外毒素，例如蓖麻毒素A、白喉毒素A或假單胞菌外毒素及其片段制備這種偶聯(lián)物。細(xì)胞毒劑還可以用同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記，以便局部傳遞毒性劑量的放射性給生血管組織、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移或經(jīng)受細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用的其它組織。
拮抗物可以與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑例如抗血管生成化合物偶聯(lián)，以輸送到正經(jīng)受血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎或與細(xì)胞與變性膠原IV型間相互作用相關(guān)的其他疾病或狀態(tài)的腫瘤或其他組織中。一種優(yōu)選的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑。一種優(yōu)選的MMP抑制劑是Marimistat(British Biotech，Oxford，United Kingdom)。
體內(nèi)血管發(fā)生抑制測(cè)定可以分析本發(fā)明的選擇性肽拮抗物調(diào)節(jié)組織中血管發(fā)生的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的試驗(yàn)，例如雞尿囊絨膜(CAM)測(cè)定，或兔眼測(cè)定，或嵌合小鼠測(cè)定，可用于監(jiān)測(cè)這種作用。這里描述了幾種非限制性技術(shù)。
一種血管發(fā)生試驗(yàn)檢測(cè)雞尿囊絨膜(CAM)中的血管發(fā)生，其被稱為CAM測(cè)定。CAM測(cè)定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，用于檢測(cè)腫瘤組織的血管發(fā)生和新血管形成(Ausprunk等人，Am.J.Pathol.，79597-618(1975)和Ossonski等人，Cancer Res.，402300-2309(1980))。
在CAM測(cè)定期間，整個(gè)組織出現(xiàn)血管發(fā)生。該試驗(yàn)檢測(cè)雞胚血管向CAM內(nèi)或向生長(zhǎng)于CAM上的組織內(nèi)的生長(zhǎng)。因此，CAM測(cè)定是一種用于體內(nèi)血管發(fā)生的有效模型。
CAM測(cè)定根據(jù)新血管生長(zhǎng)的量和程度檢測(cè)血管發(fā)生的抑制。此外，監(jiān)測(cè)移植到CAM上的任何組織例如腫瘤組織的生長(zhǎng)也是可能的。
最后，CAM測(cè)定是特別有用的，因?yàn)樵谠摐y(cè)定系統(tǒng)中存在對(duì)毒性的內(nèi)部控制。在該測(cè)定期間，把活的、發(fā)育的雞胚暴露于測(cè)試試劑。胚胎的健康是毒性的指示。
在另一種測(cè)定中，用體內(nèi)兔眼模型檢測(cè)血管發(fā)生，其被稱為“兔眼測(cè)定”。兔眼測(cè)定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，用于在存在生血管抑制劑例如沙利度胺時(shí)檢測(cè)血管發(fā)生和新血管形成。(D′Amato等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.914082-4085).
兔眼測(cè)定是用于體內(nèi)血管發(fā)生的非常公認(rèn)的分析模型，因?yàn)橐詮慕悄み吘壪蚪悄?nèi)生長(zhǎng)的兔血管為例說(shuō)明的血管發(fā)生，很容易通過(guò)天然透明的眼角膜目測(cè)到。另外，血管發(fā)生的刺激或抑制程度和量，或血管發(fā)生的消退，都可以隨時(shí)間很容易地監(jiān)測(cè)。
兔暴露于使用的任何測(cè)試試劑，因此兔的健康是測(cè)試試劑毒性的指示。
另一種試驗(yàn)在嵌合小鼠人模型中檢測(cè)血管發(fā)生，其被稱為嵌合小鼠試驗(yàn)。(Yan，等人(1993)J Clin.Invest.91986-996)。嵌合小鼠試驗(yàn)是一種用于體內(nèi)血管發(fā)生的有用的分析模型，因?yàn)橐浦驳钠つw移植物在組織學(xué)上極其類似于正常人皮膚，而且整個(gè)組織發(fā)生新血管形成，其中實(shí)際的人血管從移植的人皮膚向移植的人皮膚表面上的人腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)。人移植物的新血管形成的來(lái)源可以通過(guò)用人特異性的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行新血管系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)染色來(lái)證明。
根據(jù)新血管生長(zhǎng)消退的量和程度，嵌合小鼠試驗(yàn)證明了新血管形成的消退。此外，也可以監(jiān)測(cè)對(duì)移植到移植皮膚上的任何組織例如腫瘤組織的生長(zhǎng)的作用。最后，該試驗(yàn)是有用的，因?yàn)樵谠撛囼?yàn)系統(tǒng)中存在對(duì)毒性的內(nèi)部控制。嵌合小鼠暴露于使用的任何測(cè)試試劑，因此小鼠的健康是毒性的指示。
疾病治療本發(fā)明通常涉及如下發(fā)現(xiàn)變性膠原IV型的某些表位與選擇性拮抗物的結(jié)合能抑制包括人和其他動(dòng)物在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的組織中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎及其他與細(xì)胞與變性膠原IV型間相互作用相關(guān)的狀態(tài)或疾病，而天然膠原IV型則不能。多種疾病過(guò)程中都需要血管發(fā)生。通過(guò)抑制血管發(fā)生可以干預(yù)疾病，改善癥狀，有時(shí)候能治愈疾病。
在需要新血管生長(zhǎng)來(lái)支持異常組織生長(zhǎng)時(shí)，抑制血管發(fā)生將減少向組織的血液供給，從而有助于基于血液供給需要的組織塊的縮小。實(shí)例包括腫瘤生長(zhǎng)，其中新血管形成是腫瘤生長(zhǎng)超過(guò)幾毫米厚度并且形成實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移所持續(xù)需要的。在新血管生長(zhǎng)是與疾病相關(guān)的病理學(xué)的原因或促進(jìn)了與疾病相關(guān)的病理學(xué)時(shí)，抑制血管發(fā)生將降低疾病的有害作用。實(shí)例包括牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、炎性疾病、再狹窄、黃斑變性等等。
本發(fā)明的方法是有效的，部分因?yàn)樵撝委煂?duì)于血管發(fā)生及其他與細(xì)胞與變性IV型膠原間相互作用相關(guān)的過(guò)程，而不是其他生物學(xué)過(guò)程，有高度選擇性。單獨(dú)的變性膠原結(jié)合就可以有效地抑制血管發(fā)生及其他與細(xì)胞與變性IV型膠原間相互作用相關(guān)的過(guò)程，這一發(fā)現(xiàn)使得可以開(kāi)發(fā)具有可能的高特異性，并因此具有相對(duì)低毒性的治療組合物。
用于抑制組織中的血管發(fā)生，并因此用于實(shí)施治療血管發(fā)生相關(guān)疾病的方法的本方法包括對(duì)需要生血管治療的患者施用包含治療有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物的組合物，與結(jié)合天然膠原IV型相比，該選擇性拮抗物能選擇性結(jié)合變性的或蛋白水解的膠原IV型。因此，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的包含本發(fā)明的變性膠原IV型選擇性拮抗物的藥物組合物。
本發(fā)明提供了一種方法，用于抑制在需要這種治療的動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物和人)的組織中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、炎性疾病及其他與細(xì)胞與變性膠原IV型間相互作用相關(guān)的疾病或狀態(tài)，從而抑制組織中依賴于血管發(fā)生的事件。通常，該方法包括對(duì)動(dòng)物施用包含有效血管發(fā)生抑制量的變性膠原IV型選擇性拮抗物的組合物。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)抑制腫瘤血管發(fā)生來(lái)抑制腫瘤新血管形成的方法。在某些實(shí)施方案中，待處理的組織為患有實(shí)體(惡性)腫瘤、轉(zhuǎn)移、皮膚癌、乳腺癌、血管瘤或血管纖維瘤等癌癥的患者的腫瘤組織；將被抑制的血管發(fā)生是其中有腫瘤組織的新血管形成的腫瘤組織血管發(fā)生。通過(guò)本方法可以治療的典型實(shí)體瘤組織包括肺、胰腺、乳房、結(jié)腸、喉、卵巢、卡波西肉瘤和類似的組織。
抑制腫瘤組織血管發(fā)生是一個(gè)顯著的進(jìn)展，因?yàn)樾卵苄纬稍谀[瘤生長(zhǎng)中起重要作用。在缺乏新血管形成時(shí)，腫瘤組織不能獲得所需的養(yǎng)分，生長(zhǎng)減慢，停止另外的生長(zhǎng)，消退，并最終壞死，導(dǎo)致殺死或消除該腫瘤。另外一個(gè)顯著的進(jìn)展是通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞向變性膠原IV型上的附著，從而防止腫瘤細(xì)胞在該組織中建立，而直接抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明還包括通過(guò)阻止腫瘤中的血管發(fā)生來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)施用包含變性膠原IV型的拮抗物的生物學(xué)活性組合物，來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移形成的方法。本方法是特別有效的，因?yàn)?1)轉(zhuǎn)移的形成需要膠原變性和原發(fā)腫瘤的血管形成，以便轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞可以退出原發(fā)腫瘤，(2)腫瘤在繼發(fā)部位的建立需要膠原變性和新血管形成來(lái)支持轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。
另外，本發(fā)明提供了通過(guò)直接抑制腫瘤細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法。腫瘤細(xì)胞必須附著于組織上以在該組織中確立自己，并接著生長(zhǎng)。本發(fā)明的方法和組合物可通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用而直接抑制腫瘤細(xì)胞向組織上的附著。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明使任何前述的方法可與其它的療法如直接針對(duì)實(shí)體瘤的化學(xué)療法組合進(jìn)行?？梢栽诨瘜W(xué)治療之前、期間或者之后把血管發(fā)生抑制劑施用給需要這種治療的患者。優(yōu)選在化學(xué)治療方案之后對(duì)患者施用血管發(fā)生抑制劑。這時(shí)，腫瘤組織通過(guò)誘導(dǎo)血管發(fā)生來(lái)對(duì)毒性攻擊產(chǎn)生應(yīng)答，以通過(guò)向腫瘤組織供給血和養(yǎng)分來(lái)恢復(fù)。還優(yōu)選在對(duì)患者進(jìn)行外科手術(shù)以切除實(shí)體瘤之后，給患者施用血管發(fā)生抑制劑以預(yù)防轉(zhuǎn)移。
因此，本申請(qǐng)中所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和新血管形成的方法可被用于抑制腫瘤組織生長(zhǎng)、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移形成和促使形成的腫瘤消退。
除癌癥之外還有多種疾病其中血管發(fā)生被認(rèn)為是重要的。這些被稱為生血管疾病，包括但不限于，炎性紊亂，例如免疫和非免疫性的炎癥、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和牛皮癬；與血管的不適當(dāng)?shù)幕虿缓蠒r(shí)宜的侵入相關(guān)的紊亂，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和骨質(zhì)疏松癥中的毛細(xì)血管增生；和與癌癥相關(guān)的紊亂，例如實(shí)體瘤、實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移、血管纖維瘤、晶狀體后纖維增生癥、血管瘤、卡波西肉瘤等需要新血管形成以支持腫瘤生長(zhǎng)的癌癥。其他適合的腫瘤包括黑素瘤、癌、肉瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星形細(xì)胞瘤。
因此，抑制疾病組織中的血管發(fā)生的方法治療并改善該疾病的癥狀，并取決于該疾病，有助于治愈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種通過(guò)施用變性膠原IV型選擇性拮抗物，來(lái)抑制哺乳動(dòng)物例如人組織中的血管發(fā)生的方法。
如這里所述的，多種組織或由有組織的組織組成的器官中的任何一種，可支持疾病條件中的血管發(fā)生，其包括皮膚、肌肉、腸、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)、骨等組織，其中血管可在生血管刺激后侵入。如這里所用的組織包括所有體液、分泌物等，例如，血清、血液、腦脊液、血漿、尿、滑膜液、玻璃體液。
因此，在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，待處理的組織是發(fā)炎的組織，將被抑制的血管發(fā)生是發(fā)炎組織的血管發(fā)生，其中存在發(fā)炎組織的新血管形成。在該類中，該方法企圖抑制關(guān)節(jié)炎組織(例如，在患有慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的患者中)、免疫或非免疫發(fā)炎組織(例如，牛皮癬組織)中的血管發(fā)生。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，待處理的組織是患有糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性或新生血管性青光眼的患者的視網(wǎng)膜組織，將被抑制的血管發(fā)生是其中視網(wǎng)膜組織存在新血管形成的視網(wǎng)膜組織的血管發(fā)生。
再狹窄是平滑肌細(xì)胞(SMC)遷移并在血管中以前狹窄的部位增殖的過(guò)程。再狹窄過(guò)程中與血管相關(guān)的SMC遷移與增殖與可被本方法和組合物抑制的血管發(fā)生過(guò)程有關(guān)。本發(fā)明還涉及按照矯正血管狹窄的程序，根據(jù)本方法和組合物在患者中通過(guò)抑制與生血管相關(guān)的過(guò)程來(lái)抑制再狹窄。因此，這里所述的方法和組合物可用于經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)、外周動(dòng)脈旁路術(shù)、腸系膜動(dòng)脈旁路術(shù)和頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)或血管成形術(shù)的部位。
施用變性膠原IV型選擇性拮抗物的劑量范圍取決于拮抗物的形式和它的效力，而且是大得足以產(chǎn)生預(yù)期效果的量，其中血管發(fā)生和血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病癥狀得到改善。該劑量不應(yīng)大到引起不良副作用，例如高粘滯綜合征、肺水腫、充血性心力衰竭等等。通常，該劑量隨患者的年齡、狀況、性別和疾病的程度而變化，而且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。如果發(fā)生并發(fā)癥，該劑量還可由醫(yī)生進(jìn)行調(diào)整。
變性膠原IV型選擇性拮抗物的效力可通過(guò)多種方法測(cè)定，包括例如，這里所述的CAM測(cè)定、體內(nèi)兔眼測(cè)定、體內(nèi)嵌合小鼠人試驗(yàn)中的血管發(fā)生抑制。
治療有效量的本發(fā)明的變性膠原IV型拮抗物一般為如下肽量當(dāng)在藥學(xué)上可接受的組合物中施用時(shí)，足以達(dá)到大約每毫升(ml)0.1微克(μg)到大約200μg/ml，優(yōu)選大約1μg/ml到大約150μg/ml的血漿濃度。以質(zhì)量為大約每摩爾500克的多肽計(jì)，優(yōu)選的血漿濃度其摩爾濃度為大約2微摩爾(μM)到大約5毫摩爾(mM)，優(yōu)選大約100μM到1mM的多肽拮抗物。換句話說(shuō)，每體重的劑量可以從大約0.1mg/kg到大約300mg/kg，優(yōu)選從大約0.2mg/kg到大約200mg/kg，每天施用一次或多次，共施用一天或幾天。
變性膠原IV型選擇性拮抗物可以例如腸胃外、通過(guò)注射或通過(guò)隨時(shí)間逐漸輸注施用。預(yù)防血管發(fā)生的一種優(yōu)選施用模式是通過(guò)靜脈內(nèi)施用包含本發(fā)明的一種或多種生物活性劑的治療組合物。因此，拮抗物和其衍生物可靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮、局部、眼內(nèi)、口服、鼻內(nèi)施用，并可通過(guò)蠕動(dòng)方式輸送。本發(fā)明的治療組合物可以靜脈內(nèi)施用，例如通過(guò)單位劑量注射。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，變性膠原IV型選擇性拮抗物單次靜脈內(nèi)施用。
組合物以與劑量制劑相適應(yīng)的方式，并以治療有效量施用。施用的量和時(shí)間取決于將被治療的患者、患者系統(tǒng)利用該活性成分的能力和所希望的治療效果的程度。施用所需的活性成分的精確量取決于醫(yī)生的判斷并為每個(gè)個(gè)體所特有。不過(guò)，這里描述了系統(tǒng)應(yīng)用的合適劑量范圍，而且其取決于給藥途徑。合適的給藥方案也是可變的，但是其代表為最初時(shí)施用，接著通過(guò)隨后的注射或其他施用方式以一個(gè)或幾個(gè)小時(shí)的間隔重復(fù)施用?？蛇x地，足以將血液中的濃度保持在用于體內(nèi)治療的指定范圍內(nèi)的連續(xù)靜脈內(nèi)輸注是期待的。
血管發(fā)生的抑制和腫瘤消退可以在早至最初施用拮抗物7天后發(fā)生。優(yōu)選地，重復(fù)施用拮抗物，使組織暴露于拮抗物7天至6周，更優(yōu)選大約14至28天。
為了抑制再狹窄，變性膠原IV型選擇性拮抗物一般在狹窄緩解操作之后施用大約2天到大約28天，更通常地在該操作之后的大約前14天內(nèi)施用。
治療組合物本發(fā)明涉及可用于實(shí)施這里所述的治療方法的治療組合物。本發(fā)明的治療組合物包含藥學(xué)上可接受的載體以及這里所述的溶解或分散在其中作為活性成分的變性膠原IV型的選擇性拮抗物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性的變性膠原IV型選擇性拮抗物組合物當(dāng)施用給哺乳動(dòng)物或人類患者用于治療目的時(shí)，其不是免疫原性的。一種尤其優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是CLK肽。另一種優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是SLK肽。另一種優(yōu)選的變性膠原IV型選擇性拮抗物是KGGCLK肽。
包含溶解或分散在其中的活性成分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域所熟知的，而且不必根據(jù)制劑作出限制。這些組合物一般制備為可注射的，作為液體溶液或懸浮液，但是也可以制備使用之前適合在液體中形成溶液或者懸浮液的固體形式。制品還可以是乳化的。
活性成分可與藥學(xué)上可接受的，并與活性成分相容的賦形劑混合，而且以適合用于這里所述的治療方法的量使用。適合的賦形劑為，例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果需要，組合物可包含少量的輔助物質(zhì)，例如能增強(qiáng)活性成分的有效性的潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等等。
本發(fā)明的治療組合物可包含此處所述組分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與諸如鹽酸或磷酸的無(wú)機(jī)酸或與諸如乙酸、酒石酸、苦杏仁酸等的有機(jī)酸形成的酸加成鹽(與多肽的自由氨基形成的)。與自由羧基形成的鹽還可源自于無(wú)機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機(jī)堿，如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等。尤其優(yōu)選的是TFA(三氟乙酸)和鹽酸鹽。
藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域所熟知的。液體載體的實(shí)例有如下的無(wú)菌水溶液其除了活性成分和水之外不包含其它物質(zhì)，或包含緩沖液，如生理pH值的磷酸鈉，生理鹽水或二者，例如磷酸緩沖鹽溶液。更進(jìn)一步地，水性載體可包含一種以上的緩沖鹽，以及例如氯化鈉和氯化鉀的鹽、右旋糖、聚乙二醇及其他溶質(zhì)。
液體組合物在含有水以及不含水的情況下還可包含液相。這種另外的液相的實(shí)例有甘油、植物油例如棉籽油以及水-油乳化液。
一種治療組合物包含抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長(zhǎng)或抑制轉(zhuǎn)移的量的本發(fā)明的變性膠原IV型選擇性拮抗物，其配制成以總治療組合物重量計(jì)包含0.01到90重量百分?jǐn)?shù)的拮抗物。一種優(yōu)選的治療組合物制劑以總治療組合物重量計(jì)包含0.05到50重量百分?jǐn)?shù)的拮抗物。一種最優(yōu)選的治療組合物制劑以總治療組合物重量計(jì)包含0.1到20重量百分?jǐn)?shù)的拮抗物。重量百分?jǐn)?shù)是抑制劑與總組合物的重量比。因此，例如，0.1重量百分?jǐn)?shù)是每100克總組合物含0.1克抑制劑。
檢測(cè)方法本發(fā)明的變性膠原IV型拮抗物還適于檢測(cè)組織中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、關(guān)節(jié)炎或其他與細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用相關(guān)的疾病或狀態(tài)。這些檢測(cè)方法可以在體外和體內(nèi)使用。例如，一種體外方法是檢測(cè)活檢標(biāo)本中的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。
可直接或者間接檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記的變性膠原選擇性拮抗物與靶組織的結(jié)合。直接檢測(cè)可以在包含可檢測(cè)標(biāo)記例如熒光染料、放射性標(biāo)志、順磁性重金屬或診斷染料的所述拮抗物上進(jìn)行。
間接檢測(cè)可使用能與變性膠原IV型選擇性拮抗物相互作用的可檢測(cè)的第二試劑進(jìn)行。例如可使用能識(shí)別所述拮抗物的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體來(lái)顯示拮抗物的位置。其他的間接檢測(cè)方法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
體內(nèi)成像方法容許檢測(cè)個(gè)體體內(nèi)能特異性結(jié)合變性膠原IV型的標(biāo)記拮抗物。把標(biāo)記的拮抗物例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用給患者。體內(nèi)檢測(cè)方法包括磁共振波譜技術(shù)、正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)(PET)和單光子發(fā)射斷層掃描術(shù)(SPECT)。為了體內(nèi)成像的目的，可用的探測(cè)儀類型是選擇給定標(biāo)記中的主要因素。例如，放射性同位素和順磁性同位素特別適于體內(nèi)成像。使用的儀器類型將指導(dǎo)放射性核素的選擇。例如，選擇的放射性核素必須具有一種給定類型的儀器可檢測(cè)的衰變類型。然而，根據(jù)本發(fā)明可使用任何用于顯示診斷成像的常規(guī)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，放射性核素可以利用中間官能團(tuán)直接或者間接地與抗體結(jié)合。經(jīng)常用于結(jié)合以金屬離子形式存在的放射性同位素與抗體的中間官能團(tuán)為二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。適于作為放射性同位素的金屬離子的實(shí)例有99mTc、123I、131I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr和201Tl。特別可用于磁共振成像(“MRI”)的順磁性同位素的實(shí)例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
實(shí)施例下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是不是限制性的。
實(shí)施例1-能特異性結(jié)合變性膠原IV型表位的肽的生產(chǎn)扣除噬菌體展示用于產(chǎn)生能特異性結(jié)合變性膠原IV型的肽。肽在病毒體表面上表達(dá)為與噬菌體的外殼蛋白的融合蛋白。如下進(jìn)行淘選把噬菌體展示肽文庫(kù)與靶標(biāo)(1-4孔中為天然的膠原IV型，5孔為變性的膠原IV型)包被的微量滴定板一起孵育，洗掉未結(jié)合的噬菌體，并洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。使洗脫的噬菌體進(jìn)行重復(fù)淘選來(lái)富集有利于結(jié)合序列的庫(kù)。
第一天，膠原IV型以25μg/ml的濃度溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)中，然后把溶液煮沸15分鐘，從而產(chǎn)生熱變性的膠原。接著，使溶液冷卻到室溫。
添加100微升天然膠原IV型(未煮沸的)到4個(gè)孔中(Nunc-ImmunTMMaxisorpTM，獲自Nalge Nunc International，Rochester，NewYork)，并添加100微升變性膠原IV型(煮沸的)到第5個(gè)孔中。反復(fù)旋動(dòng)平板直到它的表面濕潤(rùn)。上面密封的平板在4℃溫度下輕輕搖晃孵育過(guò)夜。
在第2天，向10ml的LB/tet培養(yǎng)基中接種ER2738大腸桿菌菌株單菌落。LB/tet培養(yǎng)基如下制備由10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨和5g/l NaCl制備1升LB培養(yǎng)基。混合物于121℃高壓滅菌15分鐘，然后貯存于室溫。使用20mg/ml四環(huán)素乙醇溶液制備四環(huán)素原液，該四環(huán)素乙醇溶液在黑暗中貯存于-20℃，然后在使用前渦旋。LB/tet平板如下制備用LB培養(yǎng)基和15g/l瓊脂，于121℃高壓滅菌15分鐘，并冷卻至低于70℃。然后添加1ml四環(huán)素原液，并把混合物倒在平板上。平板在黑暗中貯存于4℃。
倒出第一個(gè)孔的包被溶液，該孔用TBST(TBS+0.1％(v/v)Tween-20)洗滌兩次。用50mM Tris-HCl(pH7.5)和150mM NaCl制備TBS，其于121℃高壓滅菌15分鐘并在室溫下貯存。
接著，2×1011噬菌體(10微升原始文庫(kù)，獲自New England BioLabs，Inc)用100微升TBST進(jìn)行稀釋，并移液到第一個(gè)孔。第一個(gè)孔然后于4℃輕輕地?fù)u晃60分鐘。
倒出第二個(gè)孔的包被溶液，該孔用TBST洗滌兩次。然后把第一個(gè)孔的上清液移液到第二個(gè)孔。第二孔于4℃輕輕搖晃60分鐘。
倒出第三個(gè)孔的包被溶液，該孔用TBST洗滌兩次。然后把第二個(gè)孔的上清液移液到第三個(gè)孔。第三個(gè)孔于4℃輕輕搖晃60分鐘。
倒出第四個(gè)孔的包被溶液，該孔用TBST洗滌兩次。然后把第三個(gè)孔的上清液移液到第四個(gè)孔。第四個(gè)孔于4℃輕輕搖晃60分鐘。
倒出第五個(gè)孔的包被溶液，該孔用封閉緩沖液填充(0.1MNaHCO3(pH8.6)，5mg/ml BSA，0.02％NaN3，過(guò)濾除菌并貯存于4℃)。接著，第五個(gè)孔于4℃孵育60分鐘。然后棄去封閉緩沖液溶液，第五個(gè)孔用TBST洗滌6次。然后把第四孔的上清液移液到第五個(gè)孔，第五個(gè)孔于室溫孵育60分鐘。接著，倒出第五個(gè)孔的溶液，第五個(gè)孔用TBST洗滌10次。
與第五個(gè)平板結(jié)合的噬菌體用0.2M鹽酸甘氨酸(pH2.2)進(jìn)行洗脫。
洗脫之后，對(duì)噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增并滴定。噬菌體然后用于下一輪的淘選。重復(fù)第二天的過(guò)程3次，每次都使用前一輪結(jié)尾所產(chǎn)生的噬菌體。
最后一步是分離并通過(guò)序列來(lái)鑒定肽，其產(chǎn)生CLK與SLK肽。
實(shí)施例2-變性膠原IV型的肽拮抗物阻斷腫瘤細(xì)胞向變性膠原IV型上的粘附。
進(jìn)行體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)以測(cè)定CLK與SLK肽是否與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的變性膠原IV型內(nèi)的功能性表位結(jié)合。未用組織培養(yǎng)物處理的48-孔平板用變性膠原IV型進(jìn)行包被。在存在或缺乏合成肽CLK、SLK與SDR的情況下，使人黑素瘤細(xì)胞M21(Scripps Research Institute，LaJolla，CA)粘附于包被的孔中，每個(gè)肽的濃度為250μg/ml。SDR肽是可以購(gòu)得的一種肽，其用作對(duì)照(QED Bioscience，Inc.，San Diego，California)。
把人變性膠原IV型(25μg/ml)固定在未用組織培養(yǎng)物處理的48孔平板上。對(duì)孔進(jìn)行洗滌并用1％溶于PBS(磷酸緩沖鹽溶液)的BSA(牛血清蛋白)一起于37℃孵育1小時(shí)。收獲亞會(huì)合的HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，洗滌，并重懸于包含RPMI-1640培養(yǎng)基、1mM MgCl2、0.2mM MnCl2和0.5％BSA的粘附緩沖液中。在存在或缺乏上述每種合成肽的情況下，將HUVEC(105)重懸于200μl粘附緩沖液中，并添加到每個(gè)孔中，使之于37℃附著30分鐘。除去未附著的細(xì)胞，附著細(xì)胞如Petitclerc等人(1999)Integrinαvβ3 promotes M21 melanoma growth inhuman skin by regulating tumor cell survival.Cancer Res.592724-2730所述的用結(jié)晶紫染色10分鐘。孔用PBS洗滌3次，與細(xì)胞締合的結(jié)晶紫通過(guò)添加100μl的10％乙酸進(jìn)行洗脫。通過(guò)測(cè)量洗脫的結(jié)晶紫在600nm波長(zhǎng)處的光密度來(lái)對(duì)細(xì)胞粘附進(jìn)行定量。
CLK-肽對(duì)黑素瘤細(xì)胞粘附的阻斷超過(guò)95％(圖1)。SLK-肽阻斷大約50％的黑素瘤細(xì)胞粘附。
實(shí)施例3-CLK-肽阻斷B16黑素瘤細(xì)胞向變性膠原IV型上的粘附。
未用組織培養(yǎng)物處理的48-孔平板用天然的(三股螺旋)或變性的膠原IV型進(jìn)行包被。在存在或缺乏CLK或者SHR(對(duì)照)肽的情況下，使轉(zhuǎn)移性的B16鼠黑素瘤細(xì)胞附著于包被的孔上。CLK-肽對(duì)B16細(xì)胞向變性IV型膠原上粘附的阻斷超過(guò)95％(圖2)。CLK-肽對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞向天然膠原IV型上的粘附只有很小的影響。
實(shí)施例4-在雞CAM模型中CLK-肽阻斷bFGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
用bFGF在10天大的雞胚的尿囊絨膜(CAM)內(nèi)誘導(dǎo)血管發(fā)生。24小時(shí)后，8-10個(gè)胚胎通過(guò)單次靜脈內(nèi)注射CLK-肽(100μg/胚)進(jìn)行處理。在3天的孵育期結(jié)束時(shí)，移出CAM組織進(jìn)行分析。注射CLK-肽導(dǎo)致濾盤(filter disc)的限制區(qū)(confined area)內(nèi)分支血管數(shù)目顯著減少。(圖3(a)，(b)，(c))單次注射CLK-肽抑制bFGF超過(guò)95％。(圖4)注射該肽之后沒(méi)有注意到不良作用。兩組中的每組都測(cè)試8到10個(gè)雞胚，并重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次達(dá)到總共測(cè)試24-30個(gè)雞胚。
實(shí)施例5-CLK-肽抑制B16黑素瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。
在存在或缺乏CLK-肽(100μg/胚)的情況下，對(duì)12天大的雞胚(獲自SPAFAS，North Franklin，CT)靜脈內(nèi)注射轉(zhuǎn)移性的B16黑素瘤細(xì)胞(Chambers，等人(1992)J.Natl.Cancer Inst.，Vol.84797-803)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，在每組條件下，測(cè)試8到10只雞胚，并重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。雞胚孵育7天然后處死。分析雞肺的轉(zhuǎn)移。B16黑素瘤轉(zhuǎn)移以不連續(xù)的黑色病灶出現(xiàn)。通過(guò)計(jì)算有CLK組與無(wú)CLK組的雞肺表面上的B16腫瘤病變來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)行定量。與無(wú)CLK組相比，在CLK組中B16黑素瘤轉(zhuǎn)移被抑制大約70％。(圖5)實(shí)施例6-轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的治療對(duì)60公斤的乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者抽血進(jìn)行肝功能試驗(yàn)?；颊哌M(jìn)行腹部CT掃描以記錄肝轉(zhuǎn)移的大小與數(shù)目?；颊叩目傮w醫(yī)學(xué)狀況由衛(wèi)生專業(yè)人員使用體格檢查、血液檢驗(yàn)例如全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、BUN、肌酸酐與EKG進(jìn)行評(píng)定。
把患者的體重(60公斤)乘以每體重的劑量(每公斤150毫克)計(jì)算出9000毫克的CLK-肽劑量。該CLK-肽劑量混合于水溶液中，并通過(guò)外周靜脈導(dǎo)管靜脈內(nèi)施用2小時(shí)。輸注CLK-肽之后，衛(wèi)生專業(yè)人員對(duì)患者監(jiān)控2小時(shí)觀察不良反應(yīng)的出現(xiàn)。如果不出現(xiàn)這些反應(yīng)，則讓患者回家。
CLK-肽輸注2周后，患者重新做肝功能試驗(yàn)與CT掃描。肝功能試驗(yàn)值的降低可能指示腫瘤轉(zhuǎn)移消退。CT掃描顯示轉(zhuǎn)移瘤大小縮小和/或數(shù)量減少指示轉(zhuǎn)移的成功治療。
本說(shuō)明書內(nèi)引用的所有專利和出版物在此以其全部?jī)?nèi)容引入作為參考。
還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的上述描述是為了例證與說(shuō)明的目的，而不是試圖限制本發(fā)明到這里的精確實(shí)施方式。因此應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的精神，而且本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)根據(jù)以下的權(quán)利要求進(jìn)行解釋。
權(quán)利要求
1.一種變性膠原IV型的選擇性肽拮抗物。
2.一種變性膠原IV型的選擇性肽拮抗物，其包括核心氨基酸序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
3.權(quán)利要求2的拮抗物，其中該拮抗物是包含氨基酸序列NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH的肽。
4.權(quán)利要求2的拮抗物，其中該拮抗物是包含氨基酸序列NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH的肽。
5.權(quán)利要求2的拮抗物，其中該拮抗物是由氨基酸序列NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-A-COOH組成的肽。
6.權(quán)利要求2的拮抗物，其中變性膠原IV型選擇性肽拮抗物與變性IV型膠原的結(jié)合親和力大大高于所述拮抗物與天然膠原IV型的結(jié)合親和力。
7.權(quán)利要求2的拮抗物，其中選擇性變性膠原IV型拮抗物與變性IV型膠原的結(jié)合親和力比所述拮抗物與天然膠原的結(jié)合親和力高100倍。
8.權(quán)利要求2的拮抗物，其中選擇性變性膠原IV型拮抗物抑制細(xì)胞與變性膠原IV型的相互作用。
9.一種藥物組合物，其包含選擇性變性膠原IV型拮抗物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中該組合物包含細(xì)胞毒劑。
11.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中該組合物包含放射性物質(zhì)。
12.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中該組合物包含細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。
13.一種抑制患者中血管發(fā)生的方法，其包括對(duì)患者施用血管發(fā)生抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
14.一種檢測(cè)患者中血管發(fā)生的方法，其包括對(duì)患者施用變性膠原IV型選擇性拮抗物，并檢測(cè)患者中已經(jīng)被結(jié)合的選擇性變性膠原IV型拮抗物。
15.一種治療患者的腫瘤的方法，其包括對(duì)患者施用血管發(fā)生抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
16.一種治療患者的轉(zhuǎn)移的方法，其包括對(duì)患者施用血管發(fā)生抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
17.一種治療患者的生血管疾病的方法，其包括對(duì)患者施用血管發(fā)生抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
18.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物以下述方式施用靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮、局部、眼內(nèi)、口服、鼻內(nèi)或通過(guò)蠕動(dòng)方式。
19.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物的劑量范圍為每天每公斤0.1毫克到每公斤300毫克。
20.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物的劑量范圍為10毫克到3000毫克。
21.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與化療劑組合施用。
22.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與放射性物質(zhì)組合施用。
23.權(quán)利要求13的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑一起施用。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述患者是哺乳動(dòng)物。
25.權(quán)利要求13的方法，其中所述患者是人類。
26.一種抑制患者中腫瘤細(xì)胞粘著的方法，其包括對(duì)患者施用腫瘤細(xì)胞粘著抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
27.一種檢測(cè)患者中腫瘤細(xì)胞粘著的方法，其包括對(duì)患者施用變性膠原IV型選擇性拮抗物，并檢測(cè)患者中已經(jīng)被結(jié)合的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
28.一種治療患者的腫瘤的方法，其包括對(duì)患者施用腫瘤細(xì)胞粘著抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
29.一種治療患者的轉(zhuǎn)移的方法，其包括對(duì)患者施用腫瘤細(xì)胞粘著抑制有效量的變性膠原IV型選擇性拮抗物。
30.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物以下述方式施用靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮、局部、眼內(nèi)、口服、鼻內(nèi)或通過(guò)蠕動(dòng)方式。
31.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物的劑量范圍為每天每公斤0.1毫克到每天每公斤300毫克。
32.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物的劑量范圍為10毫克到3000毫克。
33.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與化療劑組合施用。
34.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與放射性物質(zhì)組合施用。
35.權(quán)利要求26的方法，其中變性膠原IV型選擇性拮抗物與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑一起施用。
36.權(quán)利要求26的方法，其中所述患者是哺乳動(dòng)物。
37.權(quán)利要求26的方法，其中所述患者是人類。
全文摘要
本發(fā)明描述了通過(guò)施用一種拮抗物來(lái)抑制組織中的血管發(fā)生的方法，該拮抗物特異性結(jié)合蛋白水解的或變性的膠原IV型，其結(jié)合親和力大大高于與天然三股螺旋形式的膠原IV型的結(jié)合親和力。還描述了利用這種拮抗物治療腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移或再狹窄的方法，以及在體內(nèi)和體外利用這種拮抗物作為正?；蚣膊〗M織中血管發(fā)生的診斷標(biāo)記的方法。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1750841SQ200480004812
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月20日
發(fā)明者彼得·C·布魯克斯, 珍妮弗·M·羅思 申請(qǐng)人:紐約大學(xué)