、咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶和 黃酮3' -0-甲基轉(zhuǎn)移酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述 參與阿魏酸合成的酶是香草醇氧化酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法包括在包含丁香酚的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述 微生物。
10. 產(chǎn)生香草醛的方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供微生物，其中所述微生物包含編碼香草醛合酶的異源核酸，其中所述香草醛合 酶是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及 b) 在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述微生物；以及 c) 從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基中分離香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草 醛葡糖苷。 II. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟b)包括在阿魏酸的存在下培養(yǎng)所述微生 物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少ImM、優(yōu)選至 少3mM、例如至少5mM的阿魏酸。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含糖蜜或由糖蜜組 成。
14. 用于產(chǎn)生香草醛和/或香草醛衍生物的方法，所述方法包括： a) 提供阿魏酸和/或阿魏酸衍生物； b) 使所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物與香草醛合酶相接觸，其中所述香草醛合酶是能 夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶， 從而生產(chǎn)香草醛和/或香草醛衍生物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。
16. 根據(jù)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述阿魏酸衍生物是阿魏酸葡糖苷并且 所述香草醛衍生物是香草醛葡糖苷。
17. 產(chǎn)生香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷的方法，所述方法包括： a) 提供包含編碼香草醛合酶的異源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能夠催化阿魏 酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及 b) 培養(yǎng)所述植物；以及 c) 從所述植物中分離香草醛。
18. 植物，其包含編碼香草醛合酶的異源核酸和編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶的異源核酸，其中所 述香草醛合酶是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求18所述的植物，其中所述植物是雙子 葉植物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的方法或植物，其中所述植物是紅花煙草 (Nicotianatabacum)〇
21. 根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的方法或植物，其中所述植物選自鴨跖草類和 薬科（chenopodiaceae) 〇
22. 產(chǎn)生動(dòng)物飼料的方法，所述方法包括： a) 提供包含編碼香草醛合酶的異源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能夠催化阿魏 酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及 b) 培養(yǎng)所述植物；以及 c) 將所述植物加工成動(dòng)物飼料。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物為禾本科（Poaceae或Gramineae)。
24. 產(chǎn)生食物產(chǎn)品的方法，所述方法包括： a) 提供包含可食用部分的植物，其中所述植物包含編碼香草醛合酶的異源核酸，其中 所述香草醛合酶是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及 b) 培養(yǎng)所述植物；以及 c) 收獲所述可食用部分； 從而得到具有香草醛口味的食物產(chǎn)品。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述植物是番茄。
26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法、微生物或植物，其中所述香草醛合酶是 SEQIDNO:1的香草醛合酶或其功能同源物，所述功能同源物與所述SEQIDNO:1的香草 醛合酶共享至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95 %的序列 同一性。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述香草醛合酶 是SEQIDNO:21的香草醛合酶或其功能同源物，所述功能同源物與所述SEQIDNO:21的 香草醛合酶共享至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95 %的 序列同一性。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中香草醛合酶是截短 的香草醛合酶，其能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛，并且其中所述截短的香草醛 合酶是： a. 缺失最N端1至150個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 1的香草醛合酶， b. 缺失最N端21至137個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 1的香草醛合酶， c. 缺失最N端120至140個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 1的香草醛合酶， d. 缺失最N端130至140個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 1的香草醛合酶， e. 缺失最N端21至140個(gè)氨基酸的SEQIDNO:21的香草醛合酶， f. 缺失最N端21個(gè)氨基酸的SEQIDNO:1的香草醛合酶， g. 缺失最N端61個(gè)氨基酸的SEQIDNO:1的香草醛合酶， h. 缺失最N端137個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 1的香草醛合酶， i. 缺失最N端21個(gè)氨基酸的SEQIDNO:21的香草醛合酶， j. 缺失最N端140個(gè)氨基酸的SEQIDNO:21的香草醛合酶， k. 與a)至j)中任一種共享至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、 例如至少95%、例如至少98%的序列的同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能夠催 化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中香草醛合酶是截短 香草醛合酶，其能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛，并且其中所述截短的香草醛合 酶是： a) 包含SEQIDNO:1的第22至356位氨基酸或由其組成的香草醛合酶， b) 包含SEQIDNO:1的第138至356位氨基酸或由其組成的香草醛合酶， c) 包含SEQIDNO:21的第22至359位氨基酸或由其組成的香草醛合酶， d) 包含SEQIDNO:21的第141至359位氨基酸或由其組成的香草醛合酶， e) 與a)至d)中任一種共享至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、 例如至少9 5 %、例如至少98 %的序列同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能夠催化 阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述香草醛合酶是 下式的多肽： [信號(hào)肽]-X-[斷裂位點(diǎn)]-[截短的香草醛合酶] 其中X是接頭序列。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法、植物或微生物，其中所述截短的香草醛合酶如權(quán)利 要求27至28中任一項(xiàng)所限定。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30至31中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述信號(hào)肽是對(duì) 宿主生物為內(nèi)源性的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述斷裂位點(diǎn)是 對(duì)于宿主生物為內(nèi)源性的蛋白質(zhì)的斷裂位點(diǎn)。
34. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述微生物或所述植 物還包含編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶的異源核酸。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法、植物或微生物，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶是UDP-葡萄 糖：糖苷配基-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34至35中任一項(xiàng)所述的方法、植物或微生物，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移 酶是能夠催化葡萄糖轉(zhuǎn)移至香草醛從而形成香草醛葡糖苷的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法或微生物，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶是SEQIDNO:3的 UGI72E2或與其共享至少80%序列同一性的其功能同源物。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1至2、4至17和19至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是產(chǎn) 生香草醛的方法。
39. 根據(jù)權(quán)利要求1至2、4至17和19至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括 從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基和/或從所述植物中分離香草醛葡糖苷的步驟，并且其 中所述方法包括使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化的另外的步驟。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述使香草醛葡糖苷去葡糖基化的步驟包括使 所述香草醛葡糖苷與葡糖苷酶相接觸。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述葡糖苷酶是e-葡糖苷酶。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1至2、4至17和19至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是產(chǎn) 生香草醛葡糖苷的方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生香草醛及相關(guān)化合物的方法。所述方法包括使用能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的香草醛合酶。本發(fā)明還涉及表達(dá)可用于所述方法的這種香草醛合酶的宿主生物。
【IPC分類】C12N15-81, C12N15-82, C12N15-80, C12P7-24, C12N9-50
【公開號(hào)】CN104769121
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380057126
【發(fā)明人】比格爾·林德貝里默勒, 埃斯本·哈爾克耶爾漢森, 約恩·漢森, 內(nèi)塔吉·賈內(nèi)沙瓦里加拉吉
【申請(qǐng)人】埃沃爾瓦公司, 哥本哈根大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2013年11月5日
【公告號(hào)】CA2888636A1, EP2914733A1, US20150267227, WO2014067534A1