A對于人類皮膚成纖維細胞的有效性的SURVEYOR測定 法的結(jié)果。細胞在轉(zhuǎn)染后大約48小時裂解。用星號指示對應(yīng)于由成功的基因編輯產(chǎn)生的 消化產(chǎn)物的條帶。泳道標記具有形式"X.Y"，其中X是指擴增DNA的外顯子，并且Y是指基 因編輯蛋白對。例如，"1. 1"是指靶向最接近于起始密碼子的外顯子1的區(qū)域的基因編輯 蛋白對。"X.N"是指未轉(zhuǎn)染的細胞。
[0039] 圖10B描繪測試圖9的RNA對于人類皮膚成纖維細胞的毒性的SURVEYOR測定法 的結(jié)果。細胞在轉(zhuǎn)染后11天裂解。泳道和條帶如圖10A中一樣標記。用星號指示的條帶 的出現(xiàn)證實轉(zhuǎn)染的細胞保持高活力。
[0040] 圖11描繪被設(shè)計用于測試編碼體內(nèi)的基因編輯蛋白的RNA的安全性的研宄的結(jié) 果。該圖示出四組小鼠（每組10只動物）的平均體重，所述組包括一個未處理組、一個僅媒 介物組、一個經(jīng)由腫瘤內(nèi)注射用RiboSlice處理的組，和一個經(jīng)由靜脈內(nèi)注射用RiboSlice 處理的組。對于所有的處理組，從第1天至第9天，每隔一天，向動物給予5次給藥。對動 物隨訪至第17天。四個組的平均體重之間缺乏統(tǒng)計學(xué)顯著差異，證實RiboSlice的體內(nèi)安 全性。
[0041] 圖12A描繪測試包含多種長度為36個氨基酸的重復(fù)序列的基因編輯蛋白的有效 性的SURVEYOR測定法的結(jié)果。人類皮膚成纖維細胞在用編碼含有所示重復(fù)序列的基因編 輯蛋白的RNA轉(zhuǎn)染后約48小時裂解。用星號指示對應(yīng)于由成功的基因編輯產(chǎn)生的消化產(chǎn) 物的條帶。泳道標記是指在重復(fù)序列的C末端的氨基酸。"陰性"是指未轉(zhuǎn)染的細胞。
[0042]圖12B描繪測試其中每個其它重復(fù)序列的長度為36個氨基酸的基因編輯蛋白的 有效性的SURVEYOR測定法的結(jié)果。人類皮膚成纖維細胞在用編碼含有所示重復(fù)序列的基 因編輯蛋白的RNA轉(zhuǎn)染后約48小時裂解。用星號指示對應(yīng)于由成功的基因編輯產(chǎn)生的消 化產(chǎn)物的條帶。泳道標記是指在重復(fù)序列的C末端的氨基酸。"陰性"是指未轉(zhuǎn)染的細胞。
[0043] 圖13A描繪被設(shè)計用于測試帶有編碼基因編輯蛋白的核酸的RiboSliceAAV無 能力復(fù)制型病毒在體內(nèi)的安全性和功效的研宄的結(jié)果。該圖示出帶有包含人類神經(jīng)膠質(zhì) 瘤細胞的皮下腫瘤的小鼠的三個組的平均體重，所述組包括一個未處理組（無處理對照 組，"NTC"，n= 6)、一個經(jīng)由腫瘤內(nèi)注射用編碼GFP的AAV處理的組（"GFP"，n= 2)，和 一個經(jīng)由腫瘤內(nèi)注射用編碼靶向BIRC5基因的基因編輯蛋白的RiboSliceAAV處理的組 ("RiboSlice"，n= 2)。對于GFP組，在第1天向動物給藥，并且對于RiboSlice組，在第 1天和第15天給藥。對動物隨訪至第25天。三個組的平均體重之間缺乏統(tǒng)計學(xué)顯著差異， 從而證實RiboSliceAAV的體內(nèi)安全性。
[0044] 圖13B描繪在圖13A中所示研宄中的動物的標準化腫瘤體積。相比于NTC和GFP 組，在用RiboSliceAAV處理的組中的標準化腫瘤體積的較緩慢增加證實RiboSliceAAV 的體內(nèi)功效。
[0045] 圖14描繪如圖12B中一樣測試基因編輯蛋白的有效性的SURVEYOR測定法的結(jié) 果。"RiboSlice"是指其中每個其它重復(fù)序列的長度為36個氨基酸的基因編輯蛋白。"野 生型"是指未轉(zhuǎn)染的細胞。
[0046] 圖15描繪在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上離析的編碼所示蛋白質(zhì)并含有腺苷、50%鳥 苷、50% 7-脫氮鳥苷、60%尿苷、40% 5-甲基尿苷和5-甲基胞苷的RNA。
[0047] 圖16描繪測試修復(fù)模板整合至APP基因中的測定法的結(jié)果。在由用RNA和修復(fù)模 板轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生的樣品中出現(xiàn)562bp和385bp條帶指示PstI限制位點的成功整合。 是指未消化的樣品，" + "是指用PstI限制性核酸酶處理的樣品。 【【具體實施方式】】
[0048] 【定義】
[0049] "分子"意指分子實體（分子、離子、絡(luò)合物等）。
[0050] "RNA分子"意指包含RNA的分子。
[0051] "合成RNA分子"意指在細胞外部產(chǎn)生或使用生物工程改造在細胞內(nèi)部產(chǎn)生的RNA 分子，作為非限制性實例為在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中產(chǎn)生的RNA分子、通過直接化學(xué)合成產(chǎn)生的 RNA分子或在遺傳工程改造的大腸桿菌細胞中產(chǎn)生的RNA分子。
[0052] "轉(zhuǎn)染"意指使細胞與分子接觸，其中所述分子被所述細胞內(nèi)化。
[0053] "在轉(zhuǎn)染后"意指在轉(zhuǎn)染期間或之后。
[0054] "轉(zhuǎn)染試劑"意指與分子締合并促進所述分子遞送至細胞和/或所述分子被細胞內(nèi) 化的物質(zhì)或物質(zhì)混合物，作為非限制性實例為陽離子脂質(zhì)、帶電荷的聚合物或細胞滲透肽。
[0055] "基于試劑的轉(zhuǎn)染"意指使用轉(zhuǎn)染試劑進行的轉(zhuǎn)染。
[0056] "細胞培養(yǎng)基"意指可用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，作為非限制性實例為杜爾伯科改 良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，DMEM)或DMEM+10%胎牛血清 (FBS)。
[0057] "絡(luò)合培養(yǎng)基"意指向其中加入轉(zhuǎn)染試劑和待轉(zhuǎn)染的分子并且其中所述轉(zhuǎn)染試劑 與所述待轉(zhuǎn)染的分子相締合的培養(yǎng)基。
[0058] "轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基"意指可用于轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基，作為非限制性實例為杜爾伯科改良伊格 爾培養(yǎng)基（DMEM)或DMEM/F12。
[0059] "重組蛋白"意指并非在動物或人類中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽。非限制性實例包括在細 菌中產(chǎn)生的人類轉(zhuǎn)鐵蛋白、在小鼠細胞的體外培養(yǎng)物中產(chǎn)生的人類纖維連接蛋白和在水稻 植物中產(chǎn)生的人類血清白蛋白。
[0060] "脂質(zhì)載體"意指可以增加脂質(zhì)或脂溶性分子在水溶液中的溶解性的物質(zhì)，作為非 限制性實例為人類血清白蛋白或甲基_環(huán)糊精。
[0061] "0ct4蛋白"意指由POU5F1基因編碼的蛋白質(zhì)，或其天然或工程改造的變體、家族 成員、直系同源物、片段或融合構(gòu)建體，作為非限制性實例為人類0ct4蛋白（SEQIDNO:8)、 小鼠0ct4蛋白、Octl蛋白、由POU5F1假基因2編碼的蛋白、0ct4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或 0ct4-GFP融合蛋白。在一些實施方案中，0ct4蛋白包含與SEQIDN0:8具有至少70%同一 性的氨基酸序列，或者在其它實施方案中，與SEQIDN0:8具有至少75%、80%、85%、90% 或95%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，0ct4蛋白包含相對于SEQIDN0:8具有 1至20個氨基酸插入、缺失或取代（總計）的氨基酸序列?；蛘咴谄渌鼘嵤┓桨钢?，0ct4 蛋白包含相對于SEQIDN0:8具有1至15個或1至10個氨基酸插入、缺失或取代（總計） 的氨基酸序列。
[0062] "Sox2蛋白"意指由S0X2基因編碼的蛋白質(zhì)，或其天然或工程改造的變體、家族成 員、直系同源物、片段或融合構(gòu)建體，作為非限制性實例為人類Sox2蛋白（SEQIDN0:9)、小 鼠Sox2蛋白、Sox2蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Sox2-GFP融合蛋白。在一些實施方案中，Sox2 蛋白包含與SEQIDN0:9具有至少70%同一性的氨基酸序列，或者在其它實施方案中，與 SEQIDN0:9具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。在一些實施方 案中，Sox2蛋白包含相對于SEQIDN0:9具有1至20個氨基酸插入、缺失或取代（總計） 的氨基酸序列?；蛘咴谄渌鼘嵤┓桨钢校琒ox2蛋白包含相對于SEQIDN0:9具有1至15個 或1至10個氨基酸插入、缺失或取代（總計）的氨基酸序列。
[0063] "Klf4蛋白"意指由KLF4基因編碼的蛋白質(zhì)，或其天然或工程改造的變體、家族成 員、直系同源物、片段或融合構(gòu)建體，作為非限制性實例為人類Klf4蛋白（SEQIDN0:10)、 小鼠Klf4蛋白、Klf4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Klf4-GFP融合蛋白。在一些實施方案中， Klf4蛋白包含與SEQIDNO: 10具有至少70%同一性的氨基酸序列，或者在其它實施方案 中，與SEQIDN0:10具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。在一些 實施方案中，Klf4蛋白包含相對于SEQIDNO: 10具有1至20個氨基酸插入、缺失或取代 (總計）的氨基酸序列?；蛘咴谄渌鼘嵤┓桨钢?，Klf4蛋白包含相對于SEQIDNO: 10具有 1至15個或1至10個氨基酸插入、缺失或取代（總計）的氨基酸序列。
[0064] "c-Myc蛋白"意指由MYC基因編碼的蛋白質(zhì)，或其天然或工程改造的變體、家族成 員、直系同源物、片段或融合構(gòu)建體，作為非限制性實例為人類c-Myc蛋白（SEQIDN0:11)、 小鼠c_Myc蛋白、l_Myc蛋白、c_Myc(T58A)蛋白、c_Myc蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或c-Myc-GFP 融合蛋白。在一些實施方案中，c-Myc蛋白包含與SEQIDNO: 11具有至少70%同一性的 氨基酸序列，或者在其它實施方案中，與SEQIDN0:11具有至少75%、80%、85%、90%或 95%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，c-Myc蛋白包含相對于SEQIDNO: 11具有 1至20個氨基酸插入、缺失或取代（總計）的氨基酸序列。或者在其它實施方案中，c-Myc 蛋白包含相對于SEQIDNO: 11具有1至15個或1至10個氨基酸插入、缺失或取代（總 計）的氨基酸序列。
[0065] "重編程"意指造成細胞表型的變化，作為非限制性實例為造成0祖細胞分化為成 熟0細胞、造成成纖維細胞去分化為多能干細胞、造成角化細胞轉(zhuǎn)分化為心臟干細胞或造 成神經(jīng)元軸突生長。
[0066] "重編程因子"意指當細胞與分子接觸和/或細胞表達分子時，可以單獨地或與其 它分子組合造成重編程的分子，作為非限制性實例為0ct4蛋白。
[0067] "飼養(yǎng)細胞"意指可用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基或以其它方式支持培養(yǎng)物中的其它細胞的生 長的細胞。
[0068] "調(diào)節(jié)"意指使一種或多種飼養(yǎng)細胞與培養(yǎng)基接觸。
[0069] "脂肪酸"意指包含至少兩個碳原子的脂族鏈的分子，作為非限制性實例為亞油 酸、a-亞麻酸、辛酸、白三烯、前列腺素、膽固醇、糖皮質(zhì)激素、消退素、保護素、血栓素、脂氧 素、maresin、鞘脂、色氨酸、N-乙?；彼峄蚱潲}、甲酯或衍生物。
[0070] "短鏈脂肪酸"意指包含具有2至30個碳原子的脂族鏈的脂肪酸。
[0071] "白蛋白"意指在水中高度可溶的蛋白質(zhì)，作為非限制性實例為人類血清白蛋白。
[0072] "締合分子"意指與另一個分子非共價結(jié)合的分子。
[0073] "白蛋白的締合分子組分"意指結(jié)合于白蛋白多肽的一種或多種分子，作為非限制 性實例為結(jié)合于白蛋白多肽的脂質(zhì)、激素、膽固醇、鈣離子等。
[0074] "經(jīng)過處理的白蛋白"意指經(jīng)過處理以降低、去除、置換或以其它方式滅活白蛋白 的締合分子組分的白蛋白，作為非限制性實例為在高溫下溫育的人類血清白蛋白、與辛酸 鈉接觸的人類血清白蛋白或與多孔材料接觸的人類血清白蛋白。
[0075] "離子交換樹脂"意指當與含有離子的溶液接觸時可以用一個或多個不同離子置 換一個或多個離子的材料，作為非限制性實例為可以用一個或多個鈉離子置換一個或多個 鈣離子的材料。
[0076] "生殖細胞"意指精子細胞或卵子細胞。
[0077] "多能干細胞"意指可以在體內(nèi)分化成具有所有三個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層）的細胞的細胞。
[0078] "體細胞"意指并非多能干細胞或生殖細胞的細胞，作為非限制性實例為皮膚細 胞。
[0079] "葡萄糖反應(yīng)性胰島素產(chǎn)生細胞"意指當暴露于特定濃度的葡萄糖時可以產(chǎn)生和/ 或分泌一定量的胰島素并且所述量不同于（小于或大于）當細胞暴露于不同濃度的葡萄糖 時細胞產(chǎn)生和/或分泌的胰島素量的細胞，作為非限制性實例為0細胞。
[0080] "造血細胞"意指血細胞或可以分化成血細胞的細胞，作為非限制性實例為造血干 細胞或白血細胞。
[0081] "心臟細胞"意指心臟細胞或可以分化成心臟細胞的細胞，作為非限制性實例為心 臟干細胞或心肌細胞。
[0082] "視網(wǎng)膜細胞"