p的單鏈寡核苷酸隨機文庫，中間為40 bp隨機序 列，兩端分別為20 bp固定序列，序列全長為： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3' ； (D) 將500 pmol所述ssDNA隨機文庫溶解于Iml結(jié)合緩沖液中，95-100°C預(yù)變性5min， 4°C冷卻10 min，得ssDNA隨機文庫結(jié)合緩沖液；將所述ssDNA隨機文庫結(jié)合緩沖液加入到 陰極柱內(nèi)，36-37°C孵育10_15min，收集未與陰極柱結(jié)合的ssDNA隨機文庫結(jié)合緩沖液，加 入到陽極柱內(nèi)，36-37°C孵育1-1.5 h后，用淋洗緩沖液淋洗，再加入洗脫緩沖液進行洗脫， 收集洗脫緩沖液，除雜質(zhì)，使洗脫緩沖液中的ssDNA沉淀，得ssDNA沉淀； (E) 將所述ssDNA沉淀溶解，以溶解后的ssDNA為模板，加入生物素標(biāo)記的上游引物和 熒光標(biāo)記的下游引物進行對稱PCR擴增，將擴增產(chǎn)物純化，得純化產(chǎn)物； (F) 在純化產(chǎn)物中加入等體積的鏈霉親和素磁珠，37°C孵育30 min，磁分離已結(jié)合純化 產(chǎn)物的鏈霉親和素磁珠，洗滌，解鏈，得熒光標(biāo)記的ssDNA，將所述熒光標(biāo)記的ssDNA作為第 二輪篩選的次級文庫，以次級文庫為模板溶解于結(jié)合緩沖液中，加入陽極柱內(nèi)，37 °C孵育1 h，淋洗，洗脫，沉淀，溶解，對稱PCR擴增，純化，磁珠分離，解鏈，得到的ssDNA作為第三輪篩 選的次級文庫，如此循環(huán)篩選10輪，以最后一輪篩選到的熒光標(biāo)記的ssDNA作為模板，加入 上游引物和下游引物進行對稱PCR擴增，得擴增產(chǎn)物；將所述擴增產(chǎn)物連接pUCM-T載體， 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取含ssDNA單克隆進行測序，得到與鏈霉素親和性較高的ssDNA核苷酸序 列； (G) 取步驟（F)中含有與鏈霉素親和性較高的ssDNA的轉(zhuǎn)化菌進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以 所述質(zhì)粒為模板，加入生物素標(biāo)記的上游引物和熒光標(biāo)記的下游引物進行對稱PCR擴增， 純化，將純化產(chǎn)物用所述鏈霉親和素磁珠37°C孵育30 min，磁分離，洗滌，解鏈，獲得不同核 苷酸序列的熒光標(biāo)記的ssDNA ; (H) 將每種熒光標(biāo)記的ssDNA分別溶解于結(jié)合緩沖液中，加入到陽極柱內(nèi)，37°C孵育30 min，用淋洗緩沖液淋洗，加入洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫緩沖液，檢測洗脫緩沖液的熒 光強度，將洗脫緩沖液所測得的熒光強度與加入陽極柱最初的熒光標(biāo)記的ssDNA的熒光強 度相比較，其熒光強度最大的所對應(yīng)的ssDNA即為最高親和力特異識別鏈霉素的核酸適配 子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（D)和步驟（H)所述的結(jié)合緩沖液包括 20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl 和 5 mmol/L MgCl2，其 pH 值為 8. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（D)和步驟（H)所述的淋洗緩沖液包括 20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KC1、5 mmol/L MgClJP質(zhì)量比濃度為 0? 01% 的 Tween20,其 pH 值為 8. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（D)和步驟（H)所述的洗脫緩沖液包括 20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KC1、5 mmol/L MgClJP 10 mmol/L 的鏈霉素，pH 值為 8. 0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于， 步驟（E)、（F)和（G)所述的上游引物為：5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3'、下游引物為： 5' -CGCAACGCTCGCTCATACTG-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（E)、（F)和（G)所述對稱PCR擴增的體系為濃度均為10 ymol/L的上、下游引物各0. 5 y L，ddNTP I y L，buffer 2 y L，Taq 酶 0? I y L，無菌水 15. 4 y L ;擴增程序為：94°C預(yù) 變性3 min，94°C變性45 s，68°C退火45 s，72°C延伸45 s，6輪循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（C)所述的構(gòu)建構(gòu)建ssDNA隨機文庫是利用Oligo 6.0和primer premier 5.0設(shè)計80bp 的隨機單鏈寡核苷酸文庫，中間為40bp的隨機序列，兩端分別為20bp的固定序列，全長為 80bp的ssDNA隨機文庫為： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3'。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，步 驟（F)所述的循環(huán)篩選10輪中，每三輪篩選進行一次反篩選，所述反篩選是將篩選到的300 pmoL次級文庫溶于結(jié)合緩沖液中定容至I mL，95°C變性2 min，放置4°C水浴10 min，加入 到所述陰極柱中，36-37°C孵育10 min，收集未與陰極柱內(nèi)物質(zhì)結(jié)合的ssDNA隨機文庫作為 下一輪篩選的次級文庫。
9. 一種權(quán)利要求1所述的篩選方法得到的核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示的特異識別 鏈霉素的核酸適配子在鏈霉素檢測中的應(yīng)用。
10. -種定性及定量檢測鏈霉素的方法，其特征在于，包括以下步驟： (a) 制備膠體金：將20 mL質(zhì)量比濃度為0. 015%的HAuCl4W熱煮沸，邊攪拌邊加入500 U L質(zhì)量比濃度為0. 95%的檸檬酸鈉，溶液變色后，煮沸并持續(xù)8 min，冷卻至室溫，得膠體 金； (b) 定性檢測：以50 ML的膠體金中加入100 nmol/L的特異識別鏈霉素的核酸適配子 的比例將兩者混合，HAuC14制得了適配子標(biāo)記的膠體金；在適配子標(biāo)記的膠體金中加入待 測樣品，若溶液顏色為酒紅色，則待測樣品中鏈霉素濃度小于200 nmol/L ;若溶液顏色由酒 紅色變?yōu)樽仙?，則待測樣品中鏈霉素的濃度為200~800 nmol/L ;若溶液顏色由酒紅色變?yōu)?藍色，則待測樣品中鏈霉素的濃度為大于800 nmol/L ;所述特異識別鏈霉素的核酸適配子 的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示； (c) 定量檢測：在步驟（b)制得的適配子標(biāo)記的膠體金中加入濃度分別為25 nmol/L、 50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L 的鏈霉素，室 溫孵育I h，加入50 y L濃度為200 mmol/L的NaCl，在波長為A520和A620分別測定其吸 光值，以鏈霉素的濃度為橫坐標(biāo)，以同一濃度鏈霉素所述測得的A620和A520的比值為縱坐 標(biāo)，作鏈霉素濃度與A620/520比值的曲線圖，擬合其標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定樣品時，將待測樣品加 入到適配子標(biāo)記的膠體金中，測定其在波長為A520和A620的吸光值，求A620/520比值，將 其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到所對應(yīng)的鏈霉素含量值，即為待測樣品中所含鏈霉素的含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異識別鏈霉素的核酸適配子篩選方法，其步驟為：A、環(huán)氧基凝膠與鏈霉素偶聯(lián)；B、制備陰極柱和陽極柱；C、構(gòu)建ssDNA隨機文庫，對鏈霉素親和性較高的適配子的篩選及測定；D、熒光法鑒定最高親和性、特異性識別鏈霉素的核酸適配子。本發(fā)明還將篩選到的核酸適配子應(yīng)用于定性及定量檢測食品中的鏈霉素。本發(fā)明提供的篩選方法條件嚴(yán)謹(jǐn)度高，易于消除其他因素干擾，所篩選的適配子不僅具有很高的親和力和高度的特異識別性，而且能夠降低假陽性的出現(xiàn)，是一種簡單、快速、科學(xué)、精準(zhǔn)篩選適配子的新方法，將篩選到的核酸適配子與膠體金比色法相結(jié)合，能夠簡單、快速、準(zhǔn)確地檢測鏈霉素，可廣泛應(yīng)用于食品、衛(wèi)生及進出口檢驗等多個領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-10, C12N15-115, G01N33-53
【公開號】CN104745589
【申請?zhí)枴緾N201510106319
【發(fā)明人】劉中成, 樊武舫, 張艷芬, 解瑤, 趙麗君, 趙麗健, 王向歡
【申請人】河北大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月11日