專利名稱：檢測(cè)鏈霉素的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)牛奶和蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素的試紙條。
背景技術(shù)：
鏈霉素(Sti^ptomycin)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的治療，鏈霉素對(duì)雞、羊、牛、豬的各類炎癥，如雞傳染性鼻炎、豬急性支氣管炎、豬白痢、奶牛子宮內(nèi)膜炎等有很好的療效，因此經(jīng)常作為飼料添加劑使用。如果不正確使用，可造成鏈霉素殘留超標(biāo)。研究證明，鏈霉素可對(duì)腎臟和聽神經(jīng)造成不可逆轉(zhuǎn)的損耗，長(zhǎng)期使用還會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。為了保障動(dòng)物源性食品的安全，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸 藥最聞殘留限量》中規(guī)定鏈霉素在牛奶中為200 μ g/L,在肌肉、脂肪、肝中為600 μ g/kg,在腎中為 1000 μ g/kg ο目前鏈霉素殘留的檢測(cè)主要有儀器分析和免疫學(xué)方法。其中儀器分析法主要用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)，這些方法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、假陽(yáng)性少等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一定缺點(diǎn)，如樣品前處理過程復(fù)雜，儀器化程度高且價(jià)格昂貴，分析速度慢，不適合進(jìn)行大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。膠體金免疫層析試紙條已廣泛用于藥物殘留檢測(cè)中，具有操作簡(jiǎn)便、快速、不需要任何設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)展方向之一。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短的檢測(cè)鏈霉素和雙氫鏈霉素的試紙條。本實(shí)用新型的試紙條，其包括凍干有鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙，試紙由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。樣品吸收墊位于底板始端，吸水墊位于底板末端，檢測(cè)線和質(zhì)控線平行，質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處5-8mm，檢測(cè)線位于距離質(zhì)控線5-6mm。試紙樣品吸收墊為檢測(cè)端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜上有MAX標(biāo)記線，微孔試劑上具有微孔塞。為了便于運(yùn)輸和使用，試紙條盛裝于具有密封蓋的試劑桶中，試劑桶放置于具有固定用具的盒體中。本實(shí)用新型試紙條中試紙底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或?yàn)V油紙；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料；盒體為硬紙盒。本實(shí)用新型試紙條具有如下有益效果I.靈敏度高。鏈霉素檢測(cè)試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無價(jià)健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對(duì)單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。其中的鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中，在檢測(cè)過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度。因此，本實(shí)用新型試紙條具有較高的特異性和靈敏度。本試紙條對(duì)牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素檢測(cè)限為80 μ g/L,對(duì)蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素檢測(cè)限為20 μ g/L O2.顯示檢測(cè)結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。檢測(cè)時(shí)試紙以顯示紅色線“ I ”及“ I I ”印跡作為陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示在被檢測(cè)樣本液中鏈霉素、雙氫鏈霉素藥物含量高于等于試紙條對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素藥物的最低檢測(cè)限，兩條紅線“ 11 ”印跡表示在被檢測(cè)樣本中鏈霉素、雙氫鏈霉素含量低于試紙條對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素藥物的最低檢測(cè)限，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單明了，不容易出現(xiàn)結(jié)果誤判。 3.成本低，投資少。使用本實(shí)用新型試紙條，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)一步到位，成本低廉，投資少，見效快。4.易于大范圍推廣應(yīng)用。試紙條操作簡(jiǎn)單，能較好滿足牛奶、蜂蜜檢測(cè)的需求，具 有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。

圖I為本實(shí)用新型試紙結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實(shí)用新型試紙俯視圖；圖3為本實(shí)用新型微孔試劑圖；圖4為本實(shí)用新型試紙檢測(cè)結(jié)果判定圖；圖5為本實(shí)用新型試劑桶結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為本實(shí)用新型固定用具俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定用具側(cè)視圖。
具體實(shí)施方式
一、鏈霉素檢測(cè)試紙條的組裝制備I)試紙樣品吸收墊I、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊位于底板始端，吸水墊位于底板末端，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊，試紙樣品吸收墊為檢測(cè)端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線，檢測(cè)線4包被有鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。2)微孔試劑微孔試劑8具有微孔塞9，微孔試劑中凍干有鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。3)將I)試紙和2)微孔試劑組裝成試紙條，裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試紙條盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試紙條的使用I、檢測(cè)牛奶樣品[0029]待檢牛奶樣品溶液滴加200 μ I到微孔中，混勻后，室溫(20°C -25°C )孵育5min，將印有“MAX”線端朝下插入孵育后的微孔試劑后計(jì)時(shí)，室溫孵育5min，觀察結(jié)果。2、檢測(cè)蜂蜜樣品檢測(cè)蜂蜜樣品時(shí)需要先對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理準(zhǔn)確稱取O. 5g蜂蜜 到4ml離心管中，加入I. 5ml O. 2mol/L磷酸鹽緩沖液，渦動(dòng)lmin，混勻待檢。(注意1.對(duì)無結(jié)晶的蜂蜜需攪拌均勻后進(jìn)行稱量。2.如有結(jié)晶蜂蜜，置于不高于60°C水浴中溫?zé)?，等蜂蜜全部融化后攪拌均勻，冷卻至室溫后進(jìn)行稱量。)吸取待檢蜂蜜提取液100 μ I于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；將印有“MAX”線端朝下插入微孔中，使之充分浸入溶液中；室溫孵育5 IOmin后，取出根據(jù)示意圖判定結(jié)果。三、檢測(cè)結(jié)果分析鏈霉素、雙氫鏈霉素在樣本中的含量高于或等于試紙條對(duì)其的最低檢測(cè)限時(shí)，鏈霉素單克隆-膠體金標(biāo)記物與藥物結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)被封閉，從而在檢測(cè)區(qū)內(nèi)因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，不會(huì)與鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測(cè)過程中由于缺少抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，將會(huì)在檢測(cè)線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。陽(yáng)性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測(cè)線(T)不顯色，試紙以顯示紅色線“I”，判為陽(yáng)性，如圖4. a圖所示。陰性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測(cè)線(T)同時(shí)也顯示出一條紅色條帶，試紙以顯示紅色線為“ 11 ”，判為陰性，如圖4. b所示。無效當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測(cè)線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙判為無效，如圖4. c、4. d所示。四、檢測(cè)試紙條中用到的材料制備方法I、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定(I)鏈霉素半抗原的制備O. 58g鏈霉素與O. 07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室溫下反應(yīng)5_10小時(shí)，蒸除溶劑，定量得到鏈霉素半抗原。(2)免疫原的制備取鏈霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I ;取3%的戊二醛O. 5ml逐滴加入到溶液I中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，得到溶液II ;取牛血清白蛋白(BSA) 50mg用4ml水溶解得溶液III ;將溶液II緩慢加入溶液III中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜；加入NaBH430mg還原；用O. 02M的PBS透析三天，每天更換透析液三次，得鏈霉素免疫原。(3)包被原的制備取卵清白蛋白(OVA) 50mg用4ml水溶解得到溶液I ;取碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，得到溶液II ;取鏈霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III ;將溶液II緩慢加入到溶液III中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，得鏈霉素包被原。(4)鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、鏈霉素半抗原、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7. 4的PBS配成O.5mg/mL的溶液，以O(shè). Olmol/L pH7. 4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200_800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、鏈霉素半抗原、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明鏈霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、鏈霉素單克隆抗體的制備(I)制備單抗a.動(dòng)物免疫將步驟I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)
生抗血清。b.細(xì)胞融合和克隆化·[0054]取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8 I (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌鏈霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將I %氯金酸稀釋成O. 01% (質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2. 5ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用O. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7. 2，按每毫升膠體金溶液中加入10 50 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述鏈霉素單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻lOmin，加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。復(fù)溶緩沖液含牛血清白蛋白(BSA) O. I % O. 3 % (體積百分含量)、吐溫-800. 05% O. 2% (質(zhì)量百分含量)、ρΗ7· 2的O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液。5、將鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ I鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞，密封保存。6、樣品吸收墊的準(zhǔn)備將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為O. 5%(體積百分含量))、pH為7. 2,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應(yīng)膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將鏈霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(T)，包被量為l.Oyg/cm2;用O. 01mol/L、pH 7. 4PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀 其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(C)，包被量為l.Oyg/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于試紙條包括微孔試劑和試紙，試紙由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜組成。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述檢測(cè)線和質(zhì)控線平行，均呈與試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述樣品吸收墊位于底板始端，所述吸水墊位于底板末端，所述質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處5-8mm，所述檢測(cè)線位于距離質(zhì)控線5_6mm。
5.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述試紙樣品吸收墊為檢測(cè)端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜上有MAX標(biāo)記線。
6.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料，樣品吸收墊可為吸濾紙或?yàn)V油紙，吸水墊為吸水紙，反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
7.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述微孔試劑上具有微孔塞。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，所述微孔試劑中凍干有鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
9.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鏈霉素的試紙條，其特征在于所述試紙條盛裝于具塞試劑桶中，試劑桶放置于具有固定用具的盒體中，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具為硬質(zhì)支撐材料，盒體為硬紙盒。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測(cè)鏈霉素的試紙條，試紙條包括微孔試劑和試紙，試紙由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜組成，鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中，反應(yīng)膜上具有包被有鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線印跡“︱”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“︱”。試紙條放置于具塞試劑桶中，12個(gè)具塞試劑桶放置于具有12個(gè)孔的固定用具的盒體中。本實(shí)用新型試紙條具有便攜性好，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，可以在鏈霉素殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK202720232SQ20122018526
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 孫震, 陶光燦, 吳鵬, 馮靜, 田甜, 陳娟, 劉琳 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司