,在砂芯漏斗中抽干，轉(zhuǎn)移至10mL的親和層析柱中，得陰極柱。
[0036] (3)構(gòu)建ssDNA隨機(jī)文庫(kù)： 利用01igo6.0和primerpremier5.0設(shè)計(jì)80bp的隨機(jī)單鏈寡核苷酸（single strandDNA，ssDNA)文庫(kù)，中間為40bp隨機(jī)序列，兩端分別為20bp固定序列，具體序列 全長(zhǎng)為： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3'。
[0037] 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物如下： 上游引物PI:5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3'， 生物素標(biāo)記的上游引物P2 :5' -Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3' ； 下游引物P3 :5'-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3'， 熒光標(biāo)記的下游引物P4:5' -FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3'。
[0038] 所述ssDNA隨機(jī)文庫(kù)序列及上、下游引物及標(biāo)記引物均由上海生工生物工程股份 有限公司合成。
[0039] (4)適配子篩選與鑒定： a、 偶聯(lián)：取步驟（3)合成的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)500pmol溶解于lml結(jié)合緩沖液(包括20 mmol/LTris_HCl、50mmol/T,NaCl、5mmol/T,KC1 和 5mmol/T,MgCl2,pH值為8. 0)中，10CTC 變性5min，4°C冷卻10min后，將其加入到陰極柱內(nèi)，37培養(yǎng)箱中孵育10min，收集未與陰 極柱內(nèi)環(huán)氧基活化凝膠相結(jié)合的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)加入到陽(yáng)極柱內(nèi)，37°C孵育1h;然后用淋 洗緩沖液(包括20mmol/LTris-HCl，50mmol/LNaCl，5mmol/LKC1，5mmol/LMgCl2和質(zhì) 量比濃度為0. 01%的Tween20，pH值為8. 0)淋洗200個(gè)柱體積，流出速度1mL/min，最后加 入 1mL洗脫緩沖液(包括 20mmol/LTris-HCl, 50mmol/LNaCl，5mmol/LKC1，5mmol/L MgCl# 10mmol/L的鏈霉素，pH值為8. 0)，洗脫五次，收集每次洗脫緩沖液，在收集的洗脫 緩沖液中加入洗脫液1/10體積的3mol/LNaAc，使其最終濃度為0.3mol/L，充分混勻后 加入等體積的預(yù)冷異丙醇，-20°C靜置過夜，在4°C下，12000rpm離心15min，棄上清，用質(zhì) 量比濃度為70%的乙醇溶液洗兩次（12000rpm離心15min)，小心移出上清液，濾紙吸去管 壁上所有的液滴，于室溫下以使殘留的液體揮發(fā)至干，得ssDNA沉淀，記為（1，目）； b、 對(duì)稱PCR擴(kuò)增：將ssDNA沉淀用60°C預(yù)熱的100yLddH20溶解，以0. 5yL溶解后 的ssDNA為模板，用生物素標(biāo)記的上游引物P2 (5'-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3,）、熒 光標(biāo)記的下游引物P4 (5 ' -FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3 '）進(jìn)行對(duì)稱PCR擴(kuò)增，其所述對(duì) 稱PCR擴(kuò)增的體系為：取濃度均為10ymol/L的生物素標(biāo)記的上游引物P2、熒光標(biāo)記的下 游引物P4 各 0.5yL，ddNTPlyL，PCRbuffer2yL，Taq酶 0.1yL，滅菌水 15.4yL〇 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min，94°C變性45s，68°C退火45s，72°C延伸45s，6輪熱循環(huán)。 平行做5管，得到第一輪篩選擴(kuò)增產(chǎn)物，記為（1，d); c、PCR純化：PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）進(jìn)行純化，將 PCR產(chǎn)物加入到平衡好的吸附柱中，12000rpm離心，篩掉50bp以下的DNA序列，回收50 bp以上序列，去除雜帶，得純化對(duì)稱PCR產(chǎn)物，記為（1，c); d、 次級(jí)文庫(kù)的制備：先制備鏈霉親和素磁珠，取5mg(1mL)氨基磁珠超聲混勻，裝入 10mL的EP管中，用5mL的PB(0.1mol/LpH7. 4)混懸，磁分離，吸棄上清液，用PB洗 三次；加入質(zhì)量百分比濃度12%的新配的戊二醛5mL，37°C搖床孵育4h，PB洗三次；加入 1mL100yg/mL的鏈霉親和素(鏈霉親和素溶于雙蒸水中)，37°C搖床孵育4h，得鏈霉親 和素磁珠，磁分離鏈霉親和素磁珠，清洗干凈備用；將氨基磁珠和鏈霉親和素磁珠進(jìn)行紅外 檢測(cè)，驗(yàn)證其偶聯(lián)結(jié)果，結(jié)果見圖3 ;其中圖中a為氨基磁珠，b為鏈霉親和素磁珠。
[0040] 由圖3中b可見，紅外圖譜顯示鏈霉親和素磁珠在544cnT1和1606cnT1處有吸收 峰，而席夫堿的特征峰在1650~1590cnT1范圍，說(shuō)明有C=N縮振動(dòng)峰產(chǎn)生；紅外圖譜區(qū)別 于氨基磁珠，證明鏈霉親和素磁珠成功偶聯(lián)； 取6~7X107 (1mg)鏈霉親和素磁珠，用2倍B&W緩沖液（10mmol/LTris-HCl，pH 7.5，lmmol/LEDTA，2.0mol/LNaCl)洗滌磁珠一次；上磁力架1-2min，吸棄洗滌液；取100yL1倍B&W緩沖液混懸；加入100yL等體積的純化對(duì)稱PCR產(chǎn)物（1，c)，37°C搖床結(jié)合 30min;上磁力架1~2min，分離已結(jié)合對(duì)稱PCR產(chǎn)物dsDNA的鏈霉親和素磁珠，用1倍B&W 緩沖液洗滌結(jié)合dsDNA的鏈霉親和素磁珠2~3次，對(duì)鏈霉親和素磁珠結(jié)合的dsDNA進(jìn)行解 鏈，具體為：加入200yL的150mmol/LNaOH，37°C孵育15min，使dsDNA解鏈；上磁力架， 含生物素的一條ssDNA留在鏈霉親和素磁珠上并吸附在管壁，而另一條與其互補(bǔ)的熒光標(biāo) 記的ssDNA存在于上清中，記為目標(biāo)產(chǎn)物，記為（1，s)。測(cè)量鏈霉親和素磁珠制備的（1，s) 產(chǎn)物以及純化后（1，c)的熒光強(qiáng)度，計(jì)算其回收效率。計(jì)算結(jié)果為：將熒光強(qiáng)度為112. 67 熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加入鏈霉親和素磁珠解鏈后得到的上清液中熒光強(qiáng)度為38. 67,回收 率為34. 32%。并可根據(jù)熒光強(qiáng)度，計(jì)算其每一輪的親和力。
[0041] e、每一輪篩選：取目標(biāo)產(chǎn)物（1，s) 500pmol結(jié)合緩沖液定容至1mL，95°C變性2 min后，立即放置4°C水浴10min，加入陽(yáng)極柱，孵育1h，通過淋洗，洗脫得到（2,目），（2，d)，（2，c)，（2，s)。第三輪同第二輪類似，取（2，s) 500pmol與陽(yáng)極柱孵育得到（3，s)，用 于第四輪的篩選。第四輪相比于第三輪，需要進(jìn)行反篩，?。?,s) 300pmoL，用結(jié)合緩沖液 定容至1mL，95°C變性2min后，立即放置4°C水浴10min，加入陰極柱，孵育10min，轉(zhuǎn) 入陽(yáng)極柱孵育1h，通過淋洗，洗脫，進(jìn)行第四輪篩選得到（4,目），（4,d)，（4,c)，（4,s)。 [0042] 第五輪到第十輪重復(fù)第一輪的篩選，每三輪篩選進(jìn)行一次反篩，用于除去非特異 性結(jié)合的序列。將第十輪篩選到的ssDNA(10,目）作為模板加入上述上游引物P1和下游 引物P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上，將每輪的對(duì)稱PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析， 得到圖4,圖中1、2、3、4分別為第3輪、5輪、7輪、9輪篩選的PCR產(chǎn)物，M表示Marker;從圖 中可以看出條帶清晰，無(wú)雜帶；以每一輪的次級(jí)文庫(kù)測(cè)量其熒光強(qiáng)度，作為評(píng)價(jià)每一輪親和 力的標(biāo)準(zhǔn)，洗脫收集的次級(jí)文庫(kù)熒光強(qiáng)度越高，親和力越高，結(jié)果見圖5,圖中1~10分別表 示SELEX篩選每輪PCR產(chǎn)物的熒光值。
[0043] 將第十輪篩選得到的ssDNA為模板對(duì)稱PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物純化后，連接pUCM-T 載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取含ssDNA單克隆進(jìn)行測(cè)序，共測(cè)序31個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后獲得 13個(gè)不同序列的適配子，即為與鏈霉素親和性較高的ssDNA ;通過Mfold program軟件分 析ssDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)一級(jí)序列同源性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性對(duì)所獲適配子進(jìn)行分類，見 表1。
[0044] 表1ssDNA隨機(jī)區(qū)的一級(jí)序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異識(shí)別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (A) 將環(huán)氧基活化凝膠與鏈霉素偶聯(lián)緩沖液按體積比為3:10混合，35-37°C孵育 15-18h，用PBS溶液洗滌，加入乙醇胺進(jìn)行封閉，室溫孵育1-2 h ;洗滌，抽濾干燥，得鏈霉 素-環(huán)氧基凝膠偶聯(lián)復(fù)合物；所述鏈霉素偶聯(lián)緩沖液為每毫升含20 mg鏈霉素的0. lmol/L 的 Na2CO3-NaHCO3緩沖液； (B) 將所述鏈霉素-環(huán)氧基凝膠偶聯(lián)復(fù)合物裝入層析柱內(nèi)，洗脫，得陽(yáng)極柱；同時(shí)將沒 有偶聯(lián)鏈霉素的環(huán)氧基活化凝膠洗滌，裝入層析柱內(nèi)，得陰極柱； (C) 構(gòu)建ssDNA隨機(jī)文庫(kù)，設(shè)計(jì)80 b