一種特異識(shí)別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種特異識(shí)別鏈霉素的核酸適配子的 篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈霉素（Str印tomycin)是一種廣譜氨基糖苷類(lèi)抗生素，可抑制革蘭氏陰性桿菌和 部分革蘭氏陽(yáng)性桿菌的，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)中。但是，在實(shí)際使用中，由于使用 不合理或非法使用，導(dǎo)致其在肉類(lèi)、肝臟、腎臟、牛奶和蜂蜜等動(dòng)物源性食品中的大量殘留， 嚴(yán)重地危害了人類(lèi)健康，可使人產(chǎn)生一系列過(guò)敏反應(yīng)和腎毒性、耳毒性等病癥，甚至?xí)?dǎo)致 失聰。因此，F(xiàn)DA、歐盟和我國(guó)等許多國(guó)家和地區(qū)均對(duì)鏈霉素的最大殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī) 定，可見(jiàn)，檢測(cè)鏈霉素在食品中是否有殘留以及殘留量多少具有重要的意義。
[0003]目前，鏈霉素殘留的檢測(cè)方法主要有以下三種。第一，微生物法。微生物法依賴(lài) 于抗生素對(duì)微生物的生理機(jī)能、代謝過(guò)程的抑制作用，主要有瓊脂擴(kuò)散法、紙片法、杯碟法、 TTC法等。此類(lèi)方法檢測(cè)鏈霉素所需設(shè)備簡(jiǎn)單、花費(fèi)低廉，適用于大批量樣品的檢測(cè)，但是此 方法耗時(shí)長(zhǎng)、穩(wěn)定性差、靈敏度低，不能滿(mǎn)足鏈霉素的準(zhǔn)確高效測(cè)定的要求。第二，儀器分析 法。主要有氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳等。儀器分析法是一種可 靠靈敏的方法，具有高效率、高速度分離，操作自動(dòng)化的特點(diǎn)，但是也存在如下缺陷。如液相 色譜法在應(yīng)用中由于鏈霉素為非揮發(fā)性化合物，且在紫外可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收，所以采用氣相 色譜的方法時(shí)，樣品脫蛋白后，檢測(cè)需要用三甲基咪唑、七氟丁酰咪唑進(jìn)行柱后衍生或者熒 光標(biāo)記，這就導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)操作繁瑣；而且液相色譜都需要進(jìn)行樣品前處理，昂貴的儀器還有專(zhuān) 業(yè)的人員操作，因此其應(yīng)用受到一定限制。如毛細(xì)管電泳法相對(duì)于液相色譜法具有樣品用 量少的優(yōu)點(diǎn)，常見(jiàn)的分離模式是毛細(xì)管區(qū)帶和膠束電動(dòng)，但是因?yàn)槠錂z測(cè)器是傳統(tǒng)的分光 光度檢測(cè)器，檢測(cè)的靈敏度很低，所以用其檢測(cè)氨基糖苷類(lèi)的報(bào)道很少。如薄層色譜法是一 種微量、操作簡(jiǎn)單的色譜分離方法，且鏈霉素具有伯氨基，顯色劑中的茚三酮可與伯氨基發(fā) 生顯色反應(yīng)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)鏈霉素的檢測(cè)，但是該方法靈敏度和準(zhǔn)確性不高，不適合定量檢 測(cè)。第三，免疫法檢測(cè)。許多基于抗原抗體反應(yīng)的免疫反應(yīng)也能檢測(cè)鏈霉素：如酶聯(lián)免疫、 化學(xué)發(fā)光免疫、熒光免疫以及免疫膠體金等。這些方法在食品檢測(cè)方面與液相色譜相比，具 有簡(jiǎn)單、高特異性、高靈敏性、適于大批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。但是，制備單克隆抗體花費(fèi)大量的時(shí) 間和金錢(qián)，而且不同批次間性能也不穩(wěn)定，尤其是小分子的抗體不能直接篩選，小分子屬于 半抗原，只有修飾后小分子才能產(chǎn)生抗體?？梢?jiàn)，當(dāng)前這些檢測(cè)小分子鏈霉素的方法并不十 分完善，所以建立一種新的快速、精確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)鏈霉素殘留的方法是行業(yè)內(nèi)積極 探索的課題。
[0004] 適配子是用SELEX技術(shù)從體外合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫(kù)中人工篩選出的與靶 標(biāo)有高親和力和特異性的寡核苷酸序列，它可特異性識(shí)別并結(jié)合蛋白、小分子、離子、細(xì)胞 等靶物質(zhì)。由于鏈霉素等小分子抗體制備較為困難，所以適配子作為檢測(cè)小分子物質(zhì)的分 析工具，將具有廣闊的應(yīng)用前景。SELEX技術(shù)利用大容量的隨機(jī)寡核甘酸文庫(kù)與靶分子的相 互作用，從中篩選出與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，使其得到 指數(shù)級(jí)富集，如此循環(huán)數(shù)輪最終進(jìn)化成為高親和力和高特異性的寡核苷酸配體。到目前為 止，人們已篩選了許多小分子物質(zhì)的特異性適配子，并以適配子為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)了一系列小分 子物質(zhì)的檢測(cè)系統(tǒng)。但是，目前在國(guó)內(nèi)外的研宄中，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于特異性識(shí)別鏈霉素的適 配子以及利用篩選到的適配子對(duì)鏈霉素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確定性及定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。宄其 原因，主要是由于采用現(xiàn)有通用的SELEX技術(shù)篩選適配子不僅存在方法步驟繁雜，更主要 的是篩選到的適配子假陽(yáng)性高、親和性和特異性差，根本達(dá)不到應(yīng)用的需求。因此，開(kāi)發(fā)一 種用于篩選親和性高、特異識(shí)別小分子鏈霉素的適配子的方法，并將篩選到的適配子應(yīng)用 于鏈霉素的檢測(cè)中具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種特異性識(shí)別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，以解 決現(xiàn)有普通適配子的篩選方法步驟復(fù)雜，所篩選的適配子假陽(yáng)性高、親和性和特異性差的 問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明的目的之二是利用所述篩選方法獲得的特異性識(shí)別鏈霉素的適配子在檢 測(cè)鏈霉素中的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)鏈霉素存在要么檢測(cè)工序繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本較 高，要么精確度和靈敏性相對(duì)較差的問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種特異識(shí)別鏈霉素的核酸適配子的篩選方法，包括以下 步驟： (A) 將環(huán)氧基活化凝膠與鏈霉素偶聯(lián)緩沖液按體積比為3:10混合，35-37°C孵育 15_18h，用PBS溶液洗滌，加入乙醇胺進(jìn)行封閉，室溫孵育1-2h;洗滌，抽濾干燥，得鏈霉 素-環(huán)氧基凝膠偶聯(lián)復(fù)合物；所述鏈霉素偶聯(lián)緩沖液為每毫升含20mg鏈霉素的0.lmol/L 的Na2C03-NaHC03緩沖液； (B) 將所述鏈霉素-環(huán)氧基凝膠偶聯(lián)復(fù)合物裝入層析柱內(nèi)，洗脫，得陽(yáng)極柱；同時(shí)將沒(méi) 有偶聯(lián)鏈霉素的環(huán)氧基活化凝膠洗滌，裝入層析柱內(nèi)，得陰極柱； (C) 構(gòu)建ssDNA隨機(jī)文庫(kù)，設(shè)計(jì)80bp的單鏈寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)，中間為40bp隨機(jī)序 列，兩端分別為20bp固定序列，序列全長(zhǎng)為： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3' ； (D) 將500pmol所述ssDNA隨機(jī)文庫(kù)溶解于lml結(jié)合緩沖液中，95-100°C預(yù)變性5min， 4°C冷卻10min，得ssDNA隨機(jī)文庫(kù)結(jié)合緩沖液；將所述ssDNA隨機(jī)文庫(kù)結(jié)合緩沖液加入到 陰極柱內(nèi)，36-37°C孵育10-15min，收集未與陰極柱內(nèi)物質(zhì)結(jié)合的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)結(jié)合緩 沖液，加入到陽(yáng)極柱內(nèi)，36-37°C孵育1-1. 5h后，用淋洗緩沖液淋洗，再加入洗脫緩沖液進(jìn) 行洗脫，收集洗脫緩沖液，除雜質(zhì)，使洗脫緩沖液中的ssDNA沉淀，得ssDNA沉淀； (E) 將所述ssDNA沉淀溶解，以溶解后的ssDNA為模板，加入生物素標(biāo)記的上游引物和 熒光標(biāo)記的下游引物進(jìn)行對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，得純化產(chǎn)物； (F) 在純化產(chǎn)物中加入等體積的鏈霉親和素磁珠，37°C孵育30min，磁分離已結(jié)合純化 產(chǎn)物的鏈霉親和素磁珠，洗滌，解鏈，得熒光標(biāo)記的ssDNA，將所述熒光標(biāo)記的ssDNA作為第 二輪篩選的次級(jí)文庫(kù)，以次級(jí)文庫(kù)為模板溶解于結(jié)合緩沖液中，加入陽(yáng)極柱內(nèi)，37 °C孵育1 h，淋洗，洗脫，沉淀，溶解，對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，純化，磁珠分離，解鏈，得到的ssDNA作為第三輪篩 選的次級(jí)文庫(kù)，如此循環(huán)篩選10輪，以最后一輪篩選到的熒光標(biāo)記的ssDNA作為模板，加入 上游引物和下游引物進(jìn)行對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述擴(kuò)增產(chǎn)物連接pUCM-T載體，轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，挑取含ssDNA單克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到與鏈霉素親和性較高的ssDNA核苷酸 序列； (G) 取步驟（F)中含有與鏈霉素親和性較高的ssDNA所述對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取 質(zhì)粒，以所述質(zhì)粒為模板，加入生物素標(biāo)記的上游引物和熒光標(biāo)記的下游引物進(jìn)行對(duì)稱(chēng)PCR 擴(kuò)增，純化，將純化產(chǎn)物用所述鏈霉親和素磁珠37°C孵育30min，磁分離，洗滌，解鏈，獲得 不同核苷酸序列的焚光標(biāo)記的ssDNA; (H) 將每種熒光標(biāo)記的ssDNA分別溶解于結(jié)合緩沖液中，加入到陽(yáng)極柱內(nèi)，37°C孵育30 min，用淋洗緩沖液淋洗，加入洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫緩沖液，檢測(cè)洗脫緩沖液的熒 光強(qiáng)度，將洗脫緩沖液所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與加入陽(yáng)極柱最初的熒光標(biāo)記的ssDNA的熒光強(qiáng) 度相比較，其熒光強(qiáng)度最大的所對(duì)應(yīng)的ssDNA即為特異識(shí)別鏈霉素的最高親和力核酸適配 子，其核苷酸序列為：CCCGITTAAAGTAGITGAGAGTAITCCGmCTTTGTGTC(見(jiàn)SEQIDNO:l)。
[0008] 本發(fā)明所述核苷酸適配子加上固定序列后其核苷酸序列為： 5 '-ACCGACCGTGCTGGACTCTGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCCAGTATGAGCGAGCGITGCG-3'，其二級(jí)結(jié)構(gòu)特征如圖1所示。
[0009] 本發(fā)明步驟（D)和步驟（H)所述的結(jié)合緩沖液包括20mmol/LTris_HCl，50mmol/ LNaCl，5mmol/LKC1 和 5mmol/LMgCl2，其pH值為 8.0。
[0010] 本發(fā)明步驟（D)和步驟（H)所述的淋洗緩沖液包括20mmol/LTris_HCl、50mmol/ LNaCl