可檢測癌癥病人血清內(nèi)enox2蛋白的核酸適配子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可檢測癌癥病人血清內(nèi) EN0X2蛋白的核酸適配子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙酰胺腺嗓呤二核苷酸氧化酶二硫鍵交換蛋白2 (Ecto-NicotinamideAdenine DinucleotideOxidaseDisulfide-ThiolExchanger2(EN0X2))是調(diào)節(jié)細胞生長和分裂 的膜蛋白。惡性腫瘤細胞在分裂和增殖過程中，EN0X2蛋白大量表達并被切割進入血液 中，而非癌癥病人的血清中則不存在EN0X2蛋白。在癌癥發(fā)生的早期，血清中即出現(xiàn)EN0X2 蛋白。因此，檢測血液中的EN0X2蛋白可以進行癌癥的早期診斷。在不同的腫瘤細胞中， EN0X2mRNA進行選擇性剪接，產(chǎn)生選擇性剪接變體EN0X2。不同種類的癌癥病人血清中，可 檢測出不同的選擇性剪接變體，其分子量和等電點不同。所以，只需要檢測病人血清中的 EN0X2蛋白，根據(jù)其分子量和等電點即可知道病人患有哪種癌癥。
[0003]EN0X2的單鏈重組抗體（ScFv)可用于癌癥的早期診斷，雖然EN0X2單鏈重組抗體 不能直接識別不同癌癥細胞的EN0X2選擇性剪接變體，但是，利用雙向電泳可以將不同分 子量和等電點的EN0X2蛋白進行分離。分離后轉(zhuǎn)移到膜上即可用EN0X2的重組抗體進行檢 測。檢測癌癥病人血清中的EN0X2蛋白的等電點和分子量，從而確定病人患有哪種癌癥。同 時，EN0X2蛋白也可作為藥物靶點，通過抑制癌細胞的EN0X2蛋白的表達或活性，則有望開 發(fā)出有效的治療癌癥的藥物。
[0004] 而現(xiàn)有技術(shù)是用抗EN0X2蛋白的單鏈重組抗體結(jié)合此蛋白，并對血清中的EN0X2 進行檢測。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)是利用分子生物學方法，克隆獲得EN0X2重組單鏈抗體ScFv并將其植入 大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-1la。ScFv在大腸桿菌里通過IPTG誘導(dǎo)表達，產(chǎn)生大量的EN0X2重 組單鏈抗體。大腸桿菌里所表達的抗體是沒有活性的，然后通過不同的生物化學技術(shù)，包括 透析法和稀釋法等，對抗體進行變性和復(fù)性處理，獲得有活性的EN0X2重組單鏈抗體。
[0006] 為了檢測大腸桿菌表達的EN0X2重組單鏈抗體的活性，現(xiàn)有技術(shù)克隆了人類 EN0X2基因，并在大腸桿菌中進行大量表達。然后，我們把表達的EN0X2蛋白從大腸桿菌中 進行提取和純化，用于檢測EN0X2重組單鏈抗體的活性。首先，用SDS-PAGE電泳將EN0X2 蛋白分離到PAGE膠內(nèi)，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，再用EN0X2重組單鏈抗體作為第一抗體， 抗S-tag-AP作為第二抗體，對硝化纖維膜上的EN0X2進行檢測。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)用抗S-tag-AP抗體結(jié)合到EN0X2重組單鏈抗體的S-tag上，然后用AP 的底物進行染色。如果病人血清里含有EN0X2蛋白，加入AP底物后，在膜上就能顯示藍色 的斑點。檢測結(jié)果表明，EN0X2重組單鏈抗體具有結(jié)合蛋白的活性，能夠在膜上檢測出癌癥 病人血清中的EN0X2蛋白，在正常人的血清中則檢測不到EN0X2蛋白的存在。
[0008] 雖然現(xiàn)有技術(shù)通過EN0X2重組抗體也能夠檢測到EN0X2蛋白，但這一技術(shù)存在 諸多缺點和不足：（1)在很多情況下，無論單克隆抗體、多克隆抗體或者重組單鏈抗體，除 了結(jié)合其特異性抗原外，也對其他蛋白等有結(jié)合作用，因此特異性不夠強；(2)重組單鏈抗 體的親和力不高；(3)重組單鏈抗體的生產(chǎn)過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，而且在大腸桿菌里表達 后，必須對重組抗體進行變性和復(fù)性。因此，不同的生產(chǎn)批次極易發(fā)生變化，使得重組抗體 的特異性、親和力及分辨率等發(fā)生變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 解決的技術(shù)問題：
[0010] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷和問題，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足提供 一種可檢測癌癥病人血清內(nèi)EN0X2蛋白的核酸適配子及其應(yīng)用，本發(fā)明針對EN0X2蛋白的 一個序列進行核酸適配子的篩選，篩選出的適配子既可以用于EN0X2的檢測，從而進行各 種癌癥的早期診斷，又能針對EN0X2蛋白進行抑制，從而研宄開發(fā)治療癌癥的新藥，本發(fā)明 克服了重組單鏈抗體的許多缺點，獲得具有對EN0X2蛋白特異性、分辨率以及親和力高的 核酸適配子。
[0011] 技術(shù)方案：
[0012] 為了達到上述目的，本發(fā)明實施例提供如下技術(shù)方案：
[0013] 可檢測癌癥病人血清內(nèi)EN0X2蛋白的核酸適配子，其核苷酸序列如SEQIDN0. 1、 SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和或SEQIDNO. 4 所示：
[0014]SEQIDNO. 1 ：GGATAAGCCGCATTAGCTTACTTCAGTGATGCTTAAGATCTAGTA ；
[0015]SEQIDNO. 2 ：GCTTACGCGGCATTCGCTTACTTCACTGTAGCTTCAGTTCTGCTA ；
[0016]SEQIDNO. 3 ：GCAGTAGCCGCTTTCGCTTAGTTCATCCTACTTTCAGATCTACTA ；
[0017]SEQIDNO. 4 :GGAGTACGGCTTATTCCTATTGATACTGCACTTACTGGTGTAGCC。
[0018] 所述的可檢測癌癥病人血清內(nèi)EN0X2蛋白的核酸適配子，其中，所述EN0X2蛋白的 保守序列如SEQIDN0. 5所示：
[0019]SEQIDNO. 5：EEAKEKFKQALSGILIQFE
[0020] 即
[0021] GluGluAlaLysGluLysPheLysGinAlaLeuSerGlylieLeulieGinPhe Glu〇
[0022] 1 5 10 15
[0023] 所述的EN0X2蛋白的保守序列合成的EN0X2肽鏈，其氨基酸序列如SEQIDNO. 6 所示：
[0024]SEQIDNO. 6：EEAKEKFKQALSGILIQFE
[0025]即
[0026]AcGluGluAlaLysGluLysPheLysGinAlaLeuSerGlylieLeulieGin PheGluAmide。
[0027] 15 10 15
[0028] 用于篩選上述可檢測癌癥病人血清內(nèi)EN0X2蛋白的核酸適配子的DNA庫，其核苷 酸序列如SEQIDN0. 7所示，其中，N為ATGC中的任何一個，共45個N:
[0029]SEQIDNO. 7 ：
[0030]GGTATTGAGGGTCGCATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNN NNN NNN NNN GAT GGC TCT AAC TCT CCT CT〇
[0031]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述的可檢測癌癥病人血清內(nèi)EN0X2蛋白的核酸適配 子應(yīng)用于在癌癥早期診斷及通過抑制EN0X2蛋白的活性。
[0032] 核酸適配子（Aptamer)是人工合成的核酸序列，能以非常高的親合力同各種 靶分子（小分子、蛋白質(zhì)，甚至整個細胞）特異性結(jié)合。其功能類似抗體，但比抗體 具有更多的優(yōu)勢。核酸適配子是通過SELEX技術(shù)，即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù) (SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選出來的。利 用該技術(shù)可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配子。
[0033] SELEX技術(shù)的基本思想是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質(zhì)混合， 混合液中存在靶物質(zhì)與核酸的復(fù)合物，洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的 核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，進行下一輪的篩選。通過重復(fù)的篩選與擴 增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而適 配子即與靶物質(zhì)有高親和力的DNA或RNA從非常大的隨機文庫中分離出來，且純度隨SELEX 過程的進行而增高，從P摩爾到n摩爾，最后占據(jù)庫的大多數(shù)（>90%左右）。
[0034] 首先，本發(fā)明合成了單鏈DNA隨機寡核苷酸文庫，文庫容量大于1010個單鏈寡核 苷序列。文庫的中間為隨機序列，序列長度為45個核苷酸。在隨機文庫中，單鏈隨機寡核 苷酸分子易形成多種三維空間立體結(jié)構(gòu)，幾乎能與自然界所有存在的種類分子作用。由于 DNA相對RNA生產(chǎn)成本低，體內(nèi)較穩(wěn)定，不易被降解，所構(gòu)建的文庫篩選出的適配子更適合 體外診斷和體內(nèi)治療，因此，本發(fā)明選用了DNA文庫。
[0035] 本發(fā)明針對EN0X2蛋白的一個保守序列進行核酸適配子的篩選。首先，將EN0X2蛋 白的保守序列的多肽結(jié)合到磁珠上，然后把單鏈DNA庫與磁珠上的E的保守序列N0X2肽鏈 結(jié)合，去除未結(jié)合的DNA，將結(jié)合的DNA洗脫出來，用PCR方法將洗脫的DNA進行擴增。PCR 產(chǎn)物中的一條鏈帶有生物素（Biotin)，用鏈霉親和素磁珠把帶有生物素的單鏈去掉，產(chǎn)生 新的單鏈DNA進行下一輪的篩