具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合,從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅,在 此不再一一贅述。
【附圖說明】
[0043] 圖1顯示了PCR條件優(yōu)化產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中各泳道如下:泳道 M:間隔為50bp的分子量標準;泳道1-5 :退火溫度為531:、551:、571:、591:、611:的擴增產(chǎn) 物。
[0044] 圖2顯示了第1-10輪PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中各泳道如下:泳 道M:間隔為50bp的分子量標準;泳道1-10:第1-10輪的PCR產(chǎn)物。
[0045] 圖3顯示了SPR測定的每輪ssDNA和甲基苯丙胺完全抗原的結合率。
[0046] 圖4顯示了本發(fā)明部分甲基苯丙胺適體的二級結構。
[0047] 圖5顯示了本發(fā)明的一種層析側流片(或試紙條)的結構。
【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究,首次開發(fā)了特異性針對甲基苯丙胺的核酸適 體。本發(fā)明人采用SELEX技術,基于特殊結構的ssDNA文庫,成功地篩選得到對甲基苯丙胺 有高親和力和高特異性的核酸適體。本發(fā)明的適體可應用于現(xiàn)場快速靈敏地檢測甲基苯丙 胺。在此基礎上完成本發(fā)明。
[0049] 具體地,本發(fā)明人先在體外構建了全長為76bp的ssDNA文庫,以溴化氰活化瓊 脂糖為固相載體,甲基苯丙胺完全抗原為靶分子,進行SELEX篩選;并利用SPR測定每輪ssDNA文庫和甲基苯丙胺的結合親和力,通過MF0LD分析軟件對適體進行二級結構預測和 結合位點分分析。通過多次試驗,本發(fā)明人獲得了特異性適體得到逐步富集的文庫。經(jīng)過 進一步測序、分析和驗證,本發(fā)明人確定了多個具有莖-環(huán)結構的、與甲基苯丙胺存在有效 結合的核酸適體。
[0050] 試驗表明,本發(fā)明的甲基苯丙胺核酸適體可特異性結合于甲基苯丙胺并用于檢測 甲基苯丙胺,與其它藥物、毒品不發(fā)生任何交叉反應,證實了本發(fā)明核酸適體具有高度的特 異性。在鑒別不同的毒品和類似物方面,具有重大的使用價值。在靈敏度方面,本發(fā)明結果 顯示,基于核酸適體的甲基苯丙胺檢測比單克隆抗體的檢測方法靈敏度要高出2倍以上。
[0051] 本發(fā)明的核酸適體本身是一段單鏈DNA或RNA,可以耐受高溫,pH值得變化,比抗 體具有更高的穩(wěn)定性,易于長期保存。核酸適體還具有可體外人工化學合成、精確性高、重 復性好、無批次間差異等特點,在毒品、毒物的檢測方面具有廣闊的前景。
[0052] 術語
[0053] 如本文所用,術語"甲基苯丙胺"指Methamphtamine,又稱甲基安非他明。
[0054] 如本文所用,術語"含有"或"包括"可以是開放式的或封閉式的,即包括了"由…… 構成"。
[0055] SPR
[0056] SPR(表面等離子共振,Surface Plasmon Resonance)是利用金屬膜/液面界面光 的全反射連接引起的一種物理光學現(xiàn)象來分析生物分子間相互作用的儀器。
[0057]SELEX篩選
[0058]SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,指數(shù)富 集配體系統(tǒng)進化技術)技術,指由Tuerk和Gold等人開發(fā)研究的一種新的組合化學技術。 它應用大容量的隨機寡核苷酸文庫,并結合體外PCR擴增技術,以指數(shù)級富集與靶分子特 異結合的寡核苷酸,經(jīng)過多輪篩選,可獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適體(aptamer)。
[0059]SELEX篩選具有庫容量大、靶分子范圍廣等優(yōu)點。
[0060] 在本發(fā)明中,基于本發(fā)明人特殊構建的一個ssDNA文庫,通過SELEX技術,并經(jīng)過 多次和多輪篩選,成功獲得了多個特異性針對甲基苯丙胺的核酸適體。
[0061] 本發(fā)明所用的ssDNA文庫中,ssDNA的全長76bp,中間為40bp的隨機核苷酸序列, 由A、G、C、T密碼子隨機組合。這樣,在理論上,可提供44°個序列組合,即理論庫容量為1015, 因此可以很好地滿足篩選適體的需求。
[0062] 適體
[0063] 如本文所用,"適體"、"適配體"、"適配子"和"aptamer"可以互換使用,指能夠與特 定的靶分子(如甲基苯丙胺)結合的核酸序列,包括DNA適體、RNA適體、雜合類型的適體、 或其他類型的適體。此外,在本發(fā)明中,適體還包括單鏈和雙鏈形式,尤其是單鏈形式的適 體。
[0064] 如本文所用,"核酸適體"和"寡核苷酸適體"可以互換使用。核酸適體是通過SELEX 技術篩選得到的一類寡核苷酸分子,能與靶分子強特異、高親和力地結合。通常,核酸適體 是一種小的(通常約40-100堿基對)的合成寡核苷酸。
[0065] 如本文所用,術語"本發(fā)明的適體"、"本發(fā)明的核酸適體"可互換使用,指能夠特異 性地和高親和力地與甲基苯丙胺結合的核酸適體。
[0066] 在本發(fā)明中,一類優(yōu)選的適體是通過SELEX篩選獲得的,序列如SEQIDN0. :1- 5所示的核酸適體。
[0067] 本發(fā)明的核酸適體的分子質量小、免疫原性低,且可進行化學合成、改造與標記。
[0068] 如本文所用,術語"特異性"是指本發(fā)明的適體能結合于甲基苯丙胺,較佳地,指那 些能與甲基苯丙胺結合但不識別和結合于其它毒物的適體。
[0069] 本發(fā)明的適體可以用常規(guī)方法進行制備,例如人工全合成或PCR方法。
[0070] 本發(fā)明核酸適體(Aptamer)是可以折疊成三維結構的、通過空間構型互補與革巴分 子結合的一段短的單鏈寡核苷酸序列,即單鏈DNA(ssDNA)或RNA。
[0071] 另外,本發(fā)明適體可體外人工化學合成,具有精確性高、重復性好、無批次間差 異、變性與復性可逆、穩(wěn)定性好并易于長期保存等優(yōu)點。
[0072] 此外,在本發(fā)明中,還可將多功能的分子或可檢測標記物準確、有效地連接到適配 體特定位點,從而使得適體更適合對靶分子進行檢測。
[0073] 研究表明,適體與靶分子之間分子識別功能與抗體極為相似,但本發(fā)明適體對靶 分子(甲基苯丙胺)具有極高的特異性和親和力,并且易于進行功能化修飾,故非常適合制 備靈敏、快速、可靠的現(xiàn)場檢測制劑和測試片。
[0074] 本發(fā)明的核酸適體是從隨機的序列庫中篩選出來,具有廣泛的適用性和高效率。
[0075] 本發(fā)明還提供了基于本發(fā)明高親和性和特異性核酸適體的傳感器。膠體金納米顆 粒(GNPs)具有獨特的電子、光電和催化特征,使得它的應用十分引人注目。在以往的研究 中,用膠體金來開發(fā)核酸適體生物傳感器,膠體金通常用來作為重要的顯色物質,因為膠體 金顆粒具有很強的可見顏色特征。
[0076] 在本發(fā)明中,可通過膠體金交聯(lián)的核酸適體與互補序列雜交的原理,來檢測靶分 子(甲基苯丙胺)。
[0077] 檢測制品
[0078] 本發(fā)明還提供了可用于檢測甲基苯丙胺的檢測制品。
[0079] 在本發(fā)明中,代表性的檢測制品包括(但并不限于):檢測試劑、側流片、芯片、測 試條、檢測板。
[0080] 在本發(fā)明中,檢測試劑的形式?jīng)]有特別限制,可以是固態(tài)、或液體,也可以是微球、 膠體等形式。
[0081] 一類特別有用的檢測試劑是本發(fā)明適體與可檢測標記物形成的偶聯(lián)物。
[0082] 在本發(fā)明中,可檢測標記物的種類沒有特別限制,代表性的可檢測標記物包括 (但并不限于):生物素、化學發(fā)光基團、化學熒光基團、熒光蛋白、酶、膠體金、放射性同位 素、乳膠顆粒、抗體、配體、抗原、受體、或其組合。
[0083] 在另一優(yōu)選例中,所述的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷