隆出的GAMan基因，采用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切，連接到經(jīng)相同雙酶切的載體pPICz a A上，獲得重組表達(dá)載體pPICz a A_GAMan，然后轉(zhuǎn)化到BL21中，選擇陽(yáng)性克隆子采用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶。然后采用該酶在不同溫度下(60-100°C)處理1min后檢測(cè)剩余酶活，發(fā)現(xiàn)該酶在75°C下酶活損失達(dá)75%左右，這說(shuō)明直接由GAMan編碼的酸性β -甘露聚糖酶耐高溫性能較差，因此需對(duì)該基因進(jìn)行優(yōu)化改良。通過(guò)軟件PyMOL對(duì)該酸性β-甘露聚糖酶進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析，在不破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)與活性中心的前提下，對(duì)活性中心附近以及二級(jí)結(jié)構(gòu)連接處進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，增加二硫鍵，以增強(qiáng)β -甘露聚糖酶蛋白的穩(wěn)定性能及耐高溫性能。共設(shè)計(jì)了 3個(gè)待突變位點(diǎn)，分別為:+25L，+56Q, +312P，然后針對(duì)性的設(shè)計(jì)了 3對(duì)突變引物，目的基因突變位點(diǎn)統(tǒng)一為TGC，TGC左右各取12個(gè)堿基構(gòu)成正向引物；反向引物與正向引物完全互補(bǔ)。
[0045]PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶切處理后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，在LB-Amp平板篩選陽(yáng)性突變重組克隆，并對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，采用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)對(duì)比測(cè)試，優(yōu)化后的基因所編碼的酸性甘露聚糖酶的耐溫性能大大提高，在液體狀態(tài)下，90°C處理lOmin，剩余酶活仍可達(dá)到75%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)在市場(chǎng)出現(xiàn)的同類產(chǎn)品耐熱水平。
[0046]因此，經(jīng)三次定點(diǎn)突變，獲得了優(yōu)化后的酸性耐高溫甘聚糖酶基因，命名為GAHTMan。
[0047]實(shí)施例4包含酸性耐高溫β -甘露聚糖酶基因GAHTMan的畢赤酵母重組工程菌的構(gòu)建
優(yōu)化后的酸性耐高溫甘露聚糖酶基因GAHTMan，采用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切，重新連接到經(jīng)相同雙酶切的載體pPICz a A上，獲得重組表達(dá)載體pPICz a A_GAHTMan。然后采用SacI進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，電轉(zhuǎn)化后涂布于YPD (Zeo+)平板上進(jìn)行篩選，得到發(fā)酵表達(dá)水平最高的畢赤酵母重組工程菌株pPICzaA-GAHTMan-X33-180
[0048]實(shí)施例5酸性耐高溫β -甘露聚糖酶重組菌株的高效表達(dá)
將篩選獲得的酸性耐高溫β -甘露聚糖酶重組菌株pPICz a A-GAHTMan-X33-18進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。
[0049]配制10 L基本鹽培養(yǎng)基，裝入25L自動(dòng)液體發(fā)酵罐中，121°C滅菌30min，冷卻至常溫備用。用氨水或磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值至4.6，控制溶氧大于20%，發(fā)酵溫度為30°C。
[0050]整個(gè)液體發(fā)酵過(guò)程分3個(gè)階段:
第一階段為菌體培養(yǎng)階段，將重組菌pPICz a A-GAHTMan-X33-18接種至發(fā)酵罐中，接種量為10%，然后流加已滅菌的2L 50%的葡萄糖或甘油，培養(yǎng)24小時(shí)左右，以補(bǔ)完葡萄糖或甘油為標(biāo)志；
第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖或甘油補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上即表明該階段結(jié)束，為期約30-60 min；
第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20%以上，整個(gè)發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間控制在180-200小時(shí)之間。
[0051]在發(fā)酵過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定酶活，發(fā)酵過(guò)程中耐高溫甘露聚糖酶的表達(dá)情況如圖1所示，發(fā)酵192 h的發(fā)酵液酶活為11525 U/mL。
[0052]實(shí)施例6、重組酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的活性檢測(cè)檢測(cè)方法:DNS法。
[0053]I個(gè)酶活單位⑶定義為:在37°C和pH 5.5的條件下，每分鐘內(nèi)從濃度為3 mg/ml的甘露聚糖溶液中分解釋放I μ mo I的還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U ( μ mol/min)。
[0054]實(shí)施例7重組耐高溫β -甘露聚糖酶的性質(zhì)測(cè)定
1、酸性耐高溫β_甘露聚糖酶比活測(cè)定
將上述發(fā)酵液中的酸性耐高溫甘露聚糖酶通過(guò)離子交換柱(Q SepharoseTM FastFlow 1n Exchanger)純化,采用改良型Bradford試劑盒(上海Sangon公司)測(cè)定蛋白濃度，得出該酸性耐高溫甘露聚糖酶的比活為1852 U/mg。
[0055]2、酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度及pH測(cè)定
最適反應(yīng)溫度:按照β_甘露聚糖酶的檢測(cè)方法，將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度(20-700C )下反應(yīng)，測(cè)定酸性耐高溫甘露聚糖酶的酶活。以最高酶活力為100%，其它溫度下測(cè)得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對(duì)酶活。最適反應(yīng)溫度曲線見(jiàn)圖2。
[0056]最適反應(yīng)pH:將稀釋后的酶液,與不同pH (1.5~7.0)檢測(cè)條件下,檢測(cè)該酸性耐高溫β_甘露聚糖酶的酶活力，并采用最高酶活為100%，其他檢測(cè)結(jié)果與之相比，即得到不同PH檢測(cè)條件下的相對(duì)酶活。最適反應(yīng)pH曲線見(jiàn)圖3。
[0057]結(jié)果如圖2和圖3所示:該重組酸性耐高溫甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50°C，最適反應(yīng)pH為3.5。
[0058]3、酸性耐高溫甘露聚糖酶的耐熱性能測(cè)定
將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度下處理10 min,以未處理的樣品酶活力為對(duì)照，測(cè)定酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的相對(duì)酶活,結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0059]結(jié)果顯示該酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的耐熱性能良好，經(jīng)90°C處理lOmin，剩余酶活仍可達(dá)到75%以上，完全可達(dá)到飼料及其它工業(yè)用酶的要求。
[0060]4、酸性耐高溫β -甘露聚糖酶貯存穩(wěn)定性測(cè)定
將酸性耐高溫β_甘露聚糖酶固體樣品置于室溫下貯存，每月定時(shí)取樣，按照β_甘露聚糖酶的檢測(cè)方法，檢測(cè)不同保存時(shí)間的樣品酶活，以測(cè)定該酶的穩(wěn)定性能。
[0061]該酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0062]結(jié)果顯示該酸性耐高溫β_甘露聚糖酶的穩(wěn)定性能良好，優(yōu)于市場(chǎng)上的同類產(chǎn)品，在室溫條件下保存一年，剩余酶活仍可達(dá)到85%以上。
[0063]5、酸性耐高溫β -甘露聚糖酶抗胃蛋白酶、胰蛋白酶消化能力測(cè)定
取0.1mL酸性耐高溫β -甘露聚糖酶液，分別加入0.5 mL 0.1 mg/mL胃蛋白酶(pH 2.0濃度80 U/mL)和0.5 mL 0.1 mg/mL胰蛋白酶(pH 7.0濃度150 U/mL)，于37°C處理不同時(shí)間后測(cè)酶活，結(jié)果如圖6所示。
[0064]其中胃蛋白酶處理120 min后，酶活性仍達(dá)90%左右，用胰蛋白酶處理120 min后，酶活性剩余83%。這說(shuō)明該酸性耐高溫β_甘露聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。
[0065]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酸性β -甘露聚糖酶AMan，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種酸性β -甘露聚糖酶基因GAMan，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的酸性β -甘露聚糖酶，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一種酸性耐高溫β -甘露聚糖酶AHTMan，其特征在于，由權(quán)利要求1所述酸性β -甘露聚糖酶改造獲得，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
4.一種酸性耐高溫β -甘露聚糖酶基因GAHTMan，其特征在于，編碼權(quán)利要求3所述的酸性耐高溫β -甘露聚糖酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酸性耐高溫β-甘露聚糖酶基因GAHTMan，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
6.包含權(quán)利要求2所述酸性β-甘露聚糖酶基因GAMan或權(quán)利要求4所述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶基因GAHTMan的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPICza A-GAMan或pPICz a A-GAHTMan。
8.包含權(quán)利要求2所述酸性β-甘露聚糖酶基因GAMan或權(quán)利要求4所述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶基因GAHTMan的重組菌株。
9.一種制備酸性耐高溫β_甘露聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用權(quán)利要求6中的重組載體pPICza A-GAHTMan轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)酸性耐高溫β-甘露聚糖酶的表達(dá)； 3)回收并純化所表達(dá)的酸性耐高溫甘露聚糖酶。
10.權(quán)利要求1所述酸性β-甘露聚糖酶AMan或權(quán)利要求3所述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶AHTMan的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酸性β-甘露聚糖酶Aman、酸性耐高溫β-甘露聚糖酶AHTMan及其基因和應(yīng)用，提供了一種酸性β-甘露聚糖酶AMan，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列；一種酸性耐高溫β-甘露聚糖酶AHTMan，其具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；本發(fā)明還提供了編碼上述酸性β-甘露聚糖酶和酸性耐高溫β-甘露聚糖酶的基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示，還提供了包含上述兩種基因的重組載體、重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的酸性耐高溫β-甘露聚糖酶通過(guò)高效表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，在工業(yè)生產(chǎn)中可較大程度降低生產(chǎn)成本，使其在飼料、食品、石油開(kāi)采等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。
【IPC分類】C12N15-56, C12N1-19, C12N15-81, C12N9-42, C12R1-84
【公開(kāi)號(hào)】CN104651338
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510088623
【發(fā)明人】張慧君, 王俊峰, 張鵬鵬, 林海晶
【申請(qǐng)人】江蘇奕農(nóng)生物工程有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日