一種酸性耐高溫β-甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性β -甘露聚糖酶AMan、酸性耐高溫β -甘露聚糖酶AHTMan及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]β_ 甘露聚糖酶(β -1,4-D-mannanase, EC 3.2.1.78)是一類能水解含β -1, 4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纖維素酶，廣泛存在于動、植物和微生物中。
[0003]甘露聚糖是一種廣泛存在于自然界中的植物半纖維素，如豆類、魔芋的塊莖以及植物細(xì)胞壁中。β -甘露聚糖具有極強(qiáng)的吸水性，在單胃動物消化道內(nèi)易形成凝膠狀，影響營養(yǎng)物質(zhì)與消化液的接觸，降低了飼料利用率。而β_甘露聚糖酶不僅能分解β_甘露聚糖、降低消化道內(nèi)容物黏度，而且其分解β -甘露聚糖產(chǎn)生的甘露低聚糖，能作為雙歧桿菌的增殖因子、促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群的增殖，提高動物的生產(chǎn)性能。因此，β_甘露聚糖酶作為一種新型飼料添加劑已在飼料工業(yè)中廣泛應(yīng)用。在食品工業(yè)中，β_甘露聚糖可以用于生產(chǎn)甘露寡糖及其它食品加工中。在造紙工業(yè)中，將β_甘露聚糖酶和木聚糖酶等協(xié)同使用，可以減少氯的環(huán)境污染。在紡織印染工業(yè)中，β_甘露聚糖酶能有效地去除紡織印染產(chǎn)品上黏附的多余染料，以取代常規(guī)的化學(xué)處理工藝，降低能耗。在醫(yī)藥方面，β_甘露聚糖酶對防治高血脂癥，預(yù)防動脈硬化和冠心病的發(fā)生有一定作用。此外，甘露聚糖酶還是油井石油壓裂液的優(yōu)質(zhì)生物破膠劑，具有效率高、成本低、對地層傷害小等優(yōu)點。
[0004]因此，β -甘露聚糖酶作為一種新型的工業(yè)酶，具有很高的潛在應(yīng)用價值，在工業(yè)中有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]但由于β_甘露聚糖酶的生產(chǎn)水平較低，尤其是其耐高溫性能較低，極大地限制了 β_甘露聚糖酶的推廣應(yīng)用，因此開展β_甘露聚糖酶高產(chǎn)菌種的研究以及提高該酶的耐高溫性等穩(wěn)定性能，具有重要的實際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種酸性耐高溫β -甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用，通過高效表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，在工業(yè)生產(chǎn)中可較大程度降低生產(chǎn)成本，使其在飼料、食品、石油開采等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種酸性β_甘露聚糖酶AMan。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供編碼上述酸性β -甘露聚糖酶的基因GAMan。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供一種酸性耐高溫甘露聚糖酶AHTMan。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供編碼上述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的基因GAHTMan。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實例中,提供包含上述酸性β -甘露聚糖酶AMan或上述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶AHTMan的重組載體。
[0012]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供包含上述酸性β -甘露聚糖酶基因GAMan或上述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶基因GAHTMan的重組菌株。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供制備上述酸性耐高溫β -甘露聚糖酶的方法。
[0014]在本發(fā)明一個較佳實例中，提供上述酸性甘露聚糖酶AMan或酸性耐高溫β -甘露聚糖酶AHTMan的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明所涉及的生產(chǎn)上述酸性β -甘露聚糖酶AMan的黑曲霉(Aspergillusniger)，其生產(chǎn)原始菌株2008年12月3日來自并保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(保藏中心地址:北京市中關(guān)村南大街12號，郵編:100081)，菌種保藏編號:ACCC30132。
[0016]本發(fā)明提供了一種β -甘露聚糖酶AMan，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:
I MFAKLSLLSL LFSSPALGDS LQTLLYGNIS LFSTAEARAL
41 RKYIQLQYGS HYISGQQDID RffNWVEKNIN VAPAILGSLE 81 HKYSPSAVDT GGKSHAVEGS IQHAGRNGDE ALVffHWYAGA 121 QLLDTAKENQ YKGFYTDYGD TQVSEAVNDH GNGTNYKLRL 161 QDDDAIAIQL DRLDQAKVTN RKRPLHEPEG GffFffffGAQGE 201 YAFKKLffDIL YDRITRYSHL HEQVffVCNTA QADffYPGIEK 241 CDIATIDHPN AVGDRRVAAD YNKKLQTVTN NERVLAMAED 281 GPIPDPDKQA RENVNWAAEY LDGQLEENGQ DPAYSINYGR 321 VWS⑶FIEDG KQNPNQFLKH VYNDTRVVAL NWEGA.該酶蛋白由355個氨基酸組成，其分子量為40.2 IKDa0
[0017]本發(fā)明還提供了編碼上述β -甘露聚糖酶的基因GAMan，該基因的序列如SEQ IDN0.2所示:
I atgttcgcca aattgtccct cctttctctt cttttcagct ctcccgcgct gggcgactcc61 ctgcagactc tgctctatgg caacatctcg cttttcagca ccgctgaagc cagggcgctc121 cgtaagtaca tccagcttca gtatggatcg cactacatct ccggccagca ggacattgac181 cggtggaact gggtcgagaa gaacataaac gtggcccctg cgattctcgg cagcctcgaa241 cataagtact cgccttcggc tgttgacacc ggcggcaagt ctcacgccgt cgagggctct301 atccagcacg ccggccgcaa tggagacgag gccctggtgt ggcattggta cgctggcgct361 cagctactcg ataccgccaa ggagaaccag tacaaggggt tctacaccga ttatggagat421 actcaggtgt ctgaagccgt caacgaccat ggcaacggca ctaactacaa gcttcgcctc481 caggatgatg acgccatcgc tatccagctt gaccgtctgg atcaggccaa agtgactaac541 cgcaagcgcc cgctccacga gcccgagggt ggctggttct ggtggggtgc ccagggtgag601 tacgctttca agaagctgtg ggatatcctc tacgaccgca tcactcgcta ctcgcacctc661 cacgagcagg tctgggtttg caacactgct caagccgatt ggtatcccgg aatcgagaag721 tgcgacattg ccaccatcga tcaccctaac gccgttggtg accgccgtgt cgcggccgac781 tacaacaaga agctccagac cgttaccaac aacgagagag ttttggctat ggcagaggac841 ggccccattc cggaccccga taagcaggct cgtgagaacg tcaactgggc agccgagtac901 cttgacggac aactggagga gaacggtcaa gatccggcct actcgatcaa ttacggccgt961 gtttggtctg gtgacttcat cgaggatggc aagcagaacc ctaaccagtt cctgaagcac1021gtgtacaacg acacccgtgt tgtggctctg aactgggagg gggcttaa 經(jīng)檢測，該酶在pH 2.0-6.5的條件下酶活穩(wěn)定,最適pH為3.5,屬于酸性β -甘露聚糖酶，同時經(jīng)胃蛋白酶及胰蛋白酶體外水解實驗表明本發(fā)明獲得的酸性甘露聚糖酶具有良好的抗消化能力。但該酶具有一個缺點，即其耐高溫性能稍差，75°C水浴中保存10 min后，其酶活力損失達(dá)75%左右，因此，需對該酶進(jìn)行相應(yīng)的改造，以篩選獲得耐高溫性能的酸性甘露聚糖酶。
[0018]本發(fā)明優(yōu)選采用定點突變法和易錯PCR對SEQ ID N0.1所示的黑曲霉(Aspergillus niger)來源的酸性β -甘露聚糖酶AMan進(jìn)行改造,并經(jīng)過高通量篩選的方法篩選得到酸性耐高溫甘露聚糖酶AHTMan。本發(fā)明的酸性耐高溫甘露聚糖酶和原有黑曲霉生產(chǎn)的甘露聚糖酶AMan相比，有3個氨基酸的差異，突變位點由+25L，+56Q,+312Ρ，突變成+25C，+56C, +312C，整個蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中增加了兩個二硫鍵，突變后的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示:
I MFAKLSLLSL LFSSPALGDS LQTLCYGNIS LFSTAEARAL 41 RKYIQLQYGS HYISGCQDID RffNWVEKNIN VAPAILGSLE 81 HKYSPSAVDT GGKSHAVEGS IQHAGRNGDE ALVffHWYAGA 121 QLLDTAKENQ YKGFYTDYGD TQVSEAVNDH GNGTNYKLRL 161 QDDDAIAIQL DRLDQAKVTN RKRPLHEPEG GffFffffGAQGE 201 YAFKKLffDIL YDRITRYSHL HEQVffVCNTA QADffYPGIEK 241 CDIATIDHPN AVGDRRVAAD YNKKLQTVTN NERVLAMAED 281 GPIPDPDKQA R