專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，本發(fā)明還涉及一種飼料添加劑。
背景技術(shù)：
玉米-豆柏型日糧是我國(guó)飼養(yǎng)單胃動(dòng)物的主要日糧，大豆中所含有的甘露聚糖有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用。目前，我國(guó)每年大豆進(jìn)口量為4000萬(wàn)噸左右，其中80%以上用于飼料工業(yè)。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β-1，4- 吡喃甘露糖連接而成的線狀多糖，豆柏中甘露聚糖的 含量在1.2%以上。甘露聚糖具有高親水性，在單胃動(dòng)物的消化道內(nèi)大量吸水，增加了消化道內(nèi)容物的粘度，抵抗胃腸的蠕動(dòng)，直接影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，排泄物中因含有較多的有機(jī)物而造成養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境污染。甘露聚糖的完全酶解需要β -甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、β -葡糖苷酶等多種酶的協(xié)同作用。其中β_甘露聚糖酶能夠高效降解甘露聚糖的粘度，在飼料中的應(yīng)用比較廣泛。β -甘露聚糖酶是一類(lèi)能水解甘露聚糖的半纖維素酶類(lèi)，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。甘露聚糖酶能降解飼料中的甘露聚糖，不僅可以消除甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時(shí)生成的甘露寡糖在動(dòng)物生產(chǎn)中起著重要的作用。試驗(yàn)證明:甘露寡糖能提高仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，其原因可能是其提高了仔豬的免疫力，抑制了病原菌在胃腸道的增殖。另夕卜，甘露寡糖還具有一定的免疫原性，能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，與病毒、毒素結(jié)合，減緩抗原的吸收，調(diào)節(jié)腸道的菌群平衡，干擾病原菌的定植。研究還發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能夠顯著提高無(wú)菌仔豬血清和腸粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白細(xì)胞介素-2的水平，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能和小腸原始淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)小腸內(nèi)白細(xì)胞的吞噬能力和促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放IFN-Y細(xì)胞素。邵良平等報(bào)道，甘露寡糖能極顯著提高仔豬白細(xì)胞分化抗體CD3的水平。近年來(lái)，關(guān)于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越來(lái)越受到人們的重視，甘露寡糖可結(jié)合玉米赤霉烯酮，通過(guò)物理吸附或直接結(jié)合霉菌毒素，且不影響其他飼料成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法。該黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182,直接接來(lái)源于曹云鶴處，間接來(lái)源為陳有為，該菌種已于2006年10月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為:CCTCCNo M206113?！N利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法，其特征在于，所述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶方法的步驟如下:(一)制備發(fā)酵菌種:將斜面培養(yǎng)的黑曲霉(Aspergillusniger)YM33182經(jīng)液體菌種斜面菌種培養(yǎng)和一級(jí)液體培養(yǎng)后，得到發(fā)酵菌種；其具體過(guò)程是:I)斜面菌種:使用土豆培養(yǎng)基,將4°C冰箱保存的菌種劃線接種到培養(yǎng)基上,在30-35°C條件下，搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24-72小時(shí)，待孢子長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌冷卻水洗下；2) 一級(jí)液體培養(yǎng):用一支斜面試管用IOml無(wú)菌水，制備孢子懸液，使得孢子含量在lX108CFU/ml以上，取Iml孢子懸液接種到250ml種子培養(yǎng)基中，在25_35°C、250rpm條件下瓶培養(yǎng)8-48小時(shí)，獲得種子發(fā)酵液；(二)利用上述得到的菌種發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶:3)、利用得到的菌種發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶是采用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方以重量份數(shù)計(jì)包括:玉米粉35-45份、豆柏11-14份、硫酸銨1-2份、K2HPO4
3.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g,溶于lOOOmL，蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值，高壓滅菌。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶的方法，其特征在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定甘露聚糖酶的活力在60-84小時(shí)，酶活力最高；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基酶的最佳催化PH在2-6.0有較高的催化活力；3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的酶在60-70度有較好的耐熱性；4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述土豆培養(yǎng)基配方以重量份數(shù)計(jì)包括:土豆去皮切碎，15-25份；蔗糖，1.5-2.5份；瓊脂1-2.0份；自來(lái)水100份，水:原料=I: 0.015-0.2 ；5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述滅菌條件是:115_125°C高壓滅菌15-25分鐘；6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用黑曲霉發(fā)酵得到的酸性β_甘露聚糖酶水解甘露聚糖。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的酸性β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特征在于:所述甘露聚糖為魔芋精粉和玉米粉。本發(fā)明的黑曲霉在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)，能夠分泌表達(dá)β_甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最適催化溫度為40°C，最適pH值在2-6之間，在70°C時(shí)，保溫20分鐘，酶的催化活性損失不超過(guò)40%，具有較好的耐熱性。在搖瓶條件下，發(fā)酵活力最高達(dá)到1200U/mL，具有用于飼料添加劑的潛在前景。


圖1是發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的上清液甘露聚糖酶的酶活力(U/ml)；圖2是不同溫度條件下甘露聚糖酶的相對(duì)活力(百分?jǐn)?shù)％ )；圖3是甘露聚糖酶在不同pH條件下的相對(duì)催化活力(百分?jǐn)?shù)％ )；
具體實(shí)施例方式DNS試劑的配制:稱(chēng)取酒石酸鉀鈉91.0g，溶于500mL水中，加入3,5- 二硝基水楊酸3.15g、Na0H 20.0g，不超過(guò)50°C水浴溶解；再加入苯酚2.5g、無(wú)水亞硫酸鈉2.5g，攪拌溶
解，冷卻后定容至IOOOmL ;儲(chǔ)存于棕色瓶中，放置一周后使用。
β -甘露聚糖酶酶活的測(cè)定(DNS法):取待測(cè)溶液lmL，加入ImL 0.8% (質(zhì)量百分含量)甘露聚糖溶液，恒溫水浴中反應(yīng)20min，然后加入2.5mL DNS試劑(終止反應(yīng))。沸水浴煮5min,然后冷卻至室溫,用蒸懼水定容至12.5mL,測(cè)OD540。
在pH6.0和37°C條件下，每分鐘從底物半乳甘露聚糖(Sigma，G0753)中水解產(chǎn)生I μ mo I的甘露糖的所需的酶量定義為I個(gè)酶活單位，用U表示。實(shí)施例1:制備黑曲霉發(fā)酵囷種斜面培養(yǎng)基:土豆培養(yǎng)基(土豆去皮切碎，20g ;蔗糖，2.0g ;瓊脂1.5g ;自來(lái)水IOOmL, 120°C高壓滅菌20分鐘)；搖瓶種子培養(yǎng)基:土豆培養(yǎng)基(不含瓊脂)。將4°C冰箱保藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48hr，待孢子長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌冷卻水洗下。一支斜面試管用IOml無(wú)菌水，制備孢子懸液，孢子的含量在108CFU/ml以上。在250mL種子培養(yǎng)基中接種ImL孢子懸液。30°C、250rpm搖瓶培養(yǎng)20hr，獲得種子發(fā)酵液。實(shí)施例2:黑曲霉搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶工藝發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米粉40g、豆柏12.5g、硫酸銨1.5g、K2HPO4 4.0g，魔芋粉0.75g，溶于lOOOmL，蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.2，120°C高壓滅菌20分鐘。500mL搖瓶裝液量60mL。按照1: 1000的比例接種種子液，30°C、250rpm連續(xù)震蕩培養(yǎng)96hr，每隔12hr取發(fā)酵液lmL，12000rpm離心，取上清液在pH6.0和37°C條件下測(cè)定甘露聚糖酶的活力。結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例3: β -甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì) 1、最適溫度的測(cè)定:分別在20°C、30 V、40°C、50 V、60 V和70 V條件下測(cè)定酶的
相對(duì)催化活力。酶的最佳催化溫度為40°C，在30-60°C范圍內(nèi)，均保持在最佳催化活性的60%以上。結(jié)果見(jiàn)圖2。2、最適催化pH值的測(cè)定:分別在2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0緩沖液中，測(cè)定酶的
催化活性。酶的最佳催化PH4.0，在2.0-5.0范圍內(nèi)都有較高的催化活力。結(jié)果見(jiàn)圖3。3、溫度穩(wěn)定性的測(cè)定:把粗酶液分別在60°C、70°C和80°C保溫20分鐘，然后在最適催化條件下測(cè)定剩余酶。與未經(jīng)加熱處理的酶的活力相比較，計(jì)算殘余酶活。該甘露聚糖酶在70°C保溫20分鐘還有55%的殘余酶活，該酶具有較好的耐熱性。結(jié)果見(jiàn)表I。表1、甘露聚糖酶的耐熱性
權(quán)利要求
1.一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，所述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶方法的步驟如下: (一)制備發(fā)酵菌種:將斜面培養(yǎng)的黑曲霉(Aspergillusniger)YM33182經(jīng)液體菌種斜面菌種培養(yǎng)和一級(jí)液體培養(yǎng)后，得到發(fā)酵菌種；其具體過(guò)程是: 1)斜面菌種:使用土豆培養(yǎng)基，將4°C冰箱保存的菌種劃線接種到培養(yǎng)基上，在30-35°C條件下，搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24-72小時(shí)，待孢子長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌冷卻水洗下； 2)一級(jí)液體培養(yǎng):用一支斜面試管用IOml無(wú)菌水，制備孢子懸液，使得孢子含量在I X 108CFU/ml以上，取Iml孢子懸液接種到250ml種子培養(yǎng)基中，在25_35°C、250rpm條件下瓶培養(yǎng)8-48小時(shí)，獲得種子發(fā)酵液； (二)利用上述得到的菌種發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶: 3)、利用得到的菌種發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶是采用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方以重量份數(shù)計(jì)包括:玉米粉35-45份、豆柏11-14份、硫酸銨1-2份、K2HPO43.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g,溶于lOOOmL，蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值，高壓滅菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法，其特征在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定甘露聚糖酶的活力在60-84小時(shí)，酶活力最高；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基酶的最佳催化PH在2-6.0有較高的催化活力；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的酶在60-70度有較好的耐熱性；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述土豆培養(yǎng)基配方以重量份數(shù)計(jì)包括:土豆去皮切碎，15-25份； 蔗糖，1.5-2.5份；瓊脂1-2.0份；自來(lái)水100份，水:原料=I: 0.015-0.2 ；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述滅菌條件是:115-125°C高壓滅菌15-25分鐘；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用黑曲霉發(fā)酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酸性β_甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特征在于:所述甘露聚糖為魔芋精粉和玉米粉。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法。該方法所用的黑曲霉在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)，能夠分泌表達(dá)β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最適催化溫度為40℃，最適pH值在2-6之間，在70℃時(shí)，保溫20分鐘，酶的催化活性損失不超過(guò)40％，具有較好的耐熱性。在搖瓶條件下，發(fā)酵活力最高達(dá)到1200U/mL，具有用于飼料添加劑的潛在前景。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103173427SQ201210240229
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者催栩, 董建輝, 劉玉榮, 姚宏明 申請(qǐng)人:北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司, 沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司, 北京偉嘉盛邦生物技術(shù)有限公司