專利名稱：一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳酸片球菌，特別是涉及一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用。背景介紹目前飼料和畜禽養(yǎng)殖中濫用抗生素、化學(xué)合成藥物、激素導(dǎo)致一系列問題和后果，包括:畜禽產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重，直接危害人體健康，甚至產(chǎn)生“三致”，并使我國的畜禽產(chǎn)品品質(zhì)下降，缺乏市場競爭力和信任感；細(xì)菌耐藥性增強、耐藥菌株增多，結(jié)果用藥無效，威脅人類安全等。世界衛(wèi)生組織專家認(rèn)為，畜禽產(chǎn)生的各種抗藥性病菌，可以通過食品傳給人，并產(chǎn)生很難治愈的疾病，危害人類健康。同時，金霉素等藥物、馬杜霉素等易殘留和毒性較大的抗生素及合成抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致藥物殘留增加，耐藥菌株擴散，動物菌群失調(diào)，動物的免疫力受到抑制，繼發(fā)二次感染。而乳酸片球菌，產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)胃腸道菌群，維持腸道微生態(tài)平衡。在動物體內(nèi)對病原微生物有頡頏作用，可競爭性地抑制病原微生物，增強動物機體的免疫功能，產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，激活酸性蛋白酶的活性，參與機體的新陳代謝，防止有害物質(zhì)產(chǎn)生。鑒于上述飼料和畜禽養(yǎng)殖中存在的諸多問題和可開拓的空間，中國已啟動“飼料安全工程”并禁用了一批毒性和殘留較大的藥物。加快新型飼料添加劑的開發(fā)與生產(chǎn)，特別是是替代抗生素的飼料添加劑的生產(chǎn)。因此，微生態(tài)制劑作為一個綠色的飼料添加劑成為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的新型熱點，是替代抗生素的主要產(chǎn)品之一。作為消化道內(nèi)固有菌群，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制有害菌生長、增強免疫力等作用。市面上微生態(tài)制劑大多采用乳酸菌或乳酸菌于其他益生菌復(fù)配的形式，在提高畜禽采食量、防止腹瀉等方面有顯著作用。但乳酸菌作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品也存在以下一些缺陷:乳酸菌干粉的活菌數(shù)相對較低，活菌存活時間短，抗菌譜廣同時抑菌效果好的菌種少,生產(chǎn)成本相對較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一株廣譜高抑菌活性的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055。從牛乳中分離得到一株廣譜高抑菌活性的乳酸片球菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-Ι,并于2012年4月26日送中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.6055，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所郵編:100101電話:86-10-64807596。1、一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用，其特征在于:該菌為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055,具有較強的抑菌活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用，其特征在于所述的抑菌范圍活性是指對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。3、所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌的抑菌活性是指指示菌的抑菌圈直徑達到 20mm-30mm。
4、一種含高抑菌活性的乳酸片球菌的微生態(tài)制劑，其特征在于所述的微生態(tài)制劑是以乳酸片球菌為主要原料，其具體生產(chǎn)工藝如下:I)菌種選擇:所用菌種為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-1CGMCCN0.6055 ；2)斜面培養(yǎng):將-80°C甘油管保藏的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055接種于固體斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h ；3)種子培養(yǎng):將斜面培養(yǎng)的菌種接種至液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)8h ；4)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級種子液按I %接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，30°C，150-250rpm 發(fā)酵 10_20h ；上述培養(yǎng)基成分為:鹿糖2-8g/L，胃蛋白胨10-18g/L，酵母膏2-lOg/L，磷酸二氫鉀3-14g/L，氯化鈉l-10g/L，七水合硫酸鎂0.1-1.5g/L，pH調(diào)至7.0-7.35 ;斜面培養(yǎng)基另添加1.5%瓊脂粉。5)菌體富集:將發(fā)酵液通入管式離心機中，16000-21000rpm離心收集菌體。6)冷凍干燥:將離心后的菌泥與等體積的10% D-山梨醇溶液混合均勻后，置于冷凍干燥機內(nèi)凍干。

7)凍干菌粉的后處理:以葡萄糖為載體，與凍干菌粉混合，使混合后的微生態(tài)制劑活菌數(shù)達到0.8萬億cfu/g。5、一種含高抑菌活性的乳酸片球菌在微生態(tài)制劑作為飼料添加劑中的用量如下:對于正常種禽，添加量為飼料重的0.2% ；對于腹瀉種禽，添加量為飼料重的0.1 % ;對于正常仔豬，添加量為飼料重的0.2% ;對于腹瀉仔豬，添加量為飼料重的0.4%。本發(fā)明具有以下優(yōu)點:所述菌種抗菌譜廣、抑菌活性高；所述微生態(tài)制劑活菌數(shù)為目前市售的乳酸菌類微生態(tài)制劑中最高；生產(chǎn)工藝簡單，周期短，生產(chǎn)成本低。


圖1 是乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 對藤黃微球菌的抑菌效果，其圖中是兩個相同實驗劑量組；實驗劑量組是乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 的培養(yǎng)液的上清液。
具體實施例方式實施例一:乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 的高抑菌活性1.培養(yǎng)液上清的制備將斜面培養(yǎng)的乳酸片球菌接種于液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)16h,取ImL菌液12000rpm離心Imin,取上清液。2.抑菌活性檢測平板的制備將15mL完全溶化的LB瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取一完全溶化的LB瓊脂培養(yǎng)基，待其冷卻到55°C時加入指示菌混勻，取IOmL混有指示菌的培養(yǎng)基倒入放有牛津杯的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成檢測平板。3.抑菌活性的測定取200 μ L培養(yǎng)液上清加入檢測平板的孔中，4°C放置24h后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，測量抑菌圈大小20mm-30mm。實施例二:高活菌數(shù)微生態(tài)制劑制備工藝I)菌種選擇:所用菌種為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCCN0.6055。2)斜面培養(yǎng):將-80°C甘油管保藏的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055接種于固體斜面培養(yǎng)基,30°C培養(yǎng)24_30h。3)種子培養(yǎng):將斜面培養(yǎng)的菌種接種至液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)8h。4)發(fā)酵罐培養(yǎng):將種子液按I %接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，30°C，IOOrpm發(fā)酵20h。上述培養(yǎng)基成分為(g/L):蔗糖4，胃蛋白胨12，酵母膏4，磷酸二氫鉀5，氯化鈉2，七水合硫酸鎂0.2，pH調(diào)至7.0 ;斜面培養(yǎng)基另添加1.5%瓊脂粉5)菌體富集:將發(fā)酵液通入管式離心機中，20000rpm離心收集菌體。6)冷凍干燥:將離心后的菌泥與等體積的10% D-山梨醇溶液混合均勻后，置于冷凍干燥機內(nèi)凍干。7)凍干菌粉的后處理:以葡萄糖為載體，與凍干菌粉混合，使混合后的微生態(tài)制劑活菌數(shù)達到I萬億cf u/g。
權(quán)利要求
1.一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用，其特征在于:該菌為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-1 CGMCC N0.6055,具有較強的抑菌活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用，其特征在于所述的抑菌范圍活性是指對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及應(yīng)用，其特征在于所述的抑菌活性是指指示菌的抑菌圈直 徑達到20mm-30mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株廣譜高抑菌活性的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-1 CGMCC No.6055，以及利用該菌通過高密度液體深層發(fā)酵、離心富集、真空冷凍干燥處理得到粉狀微生態(tài)制劑。該乳酸菌抗菌譜廣，對于革蘭氏陽性菌及陰性菌都有較好抗菌作用；抗菌活性高。該菌制成的微生態(tài)制劑工藝簡單、生產(chǎn)周期短、成本低廉，每克干粉所含活菌數(shù)近萬億cfu以上。
文檔編號C12N1/20GK103173373SQ20121024022
公開日2013年6月26日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者姚宏明, 劉玉榮, 董建輝, 催栩 申請人:北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司, 北京偉嘉盛邦生物技術(shù)有限公司, 北京聯(lián)合盛邦生物技術(shù)有限公司