液；取1mL 200 μ M的異槲皮苷樣品液，用DMSO稀釋至20mL得100 μ M的異槲皮苷樣品液；取1mL 100 μ M的異槲皮苷樣品液，用DMSO稀釋至20mL得50 μ M的異槲皮苷樣品液。
[0021](2)配制醋酸緩沖溶液:量取1.155mL冰醋酸稀釋至10mL,取4.8mL為A溶液；稱取2.72g乙酸鈉結晶加水溶解定容至10mL,取45.2mL為B溶液；混合溶液A、B,以水定容至10mL,混勻。精確測定其PH，用溶液A或B將其PH調(diào)至5.6即可；
(2)配制透明質(zhì)酸酶溶液:稱取透明質(zhì)酸酶12.5mg (801uint/mg)至于燒杯中加入8mL醋酸緩沖溶液，濃度為1250unit/mL ；
(3)配制0.5mg/mL透明質(zhì)酸鈉溶液:稱取透明質(zhì)酸鈉5mg,加入1mL醋酸緩沖溶液,得透明質(zhì)酸
鈉溶液；
(4)配制埃爾利希試劑:稱取0.8g對-二甲氨基苯甲醒溶于15mL濃鹽酸和15mL無水乙醇中；
(5)配制乙酰丙酮溶液:取乙酰丙酮3.5mL溶于50mL碳酸鈉溶液(1.0mol/L)，此溶液在用前配制；
(6)樣品抗過敏活性檢測:取0.1mLCaCl2溶液(2.5mmol/L)和0.5mL透明質(zhì)酸酶液，37°C保溫培養(yǎng)20min，加入待測樣品液0.5mL, 37°C保溫培養(yǎng)40min ;加入0.5mL透明質(zhì)酸鈉溶液，37°C保溫35min，常溫放置5min ;加入0.1mLNaOH溶液(5mol/L)和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加熱15min后立即冷卻5min ;加入埃爾利希試劑1.0mL并用3.0mL無水乙醇進行稀釋，放置20min顯色，測定吸光度。
[0022]透明質(zhì)酶抑制率=[(A-B)-(C-D) ]/( A-B) X 100%
式中，A為對照溶液ABS值(吸光度)(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液)；B為對照空白溶液ABS值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液)；C為試樣溶液ABS值；D為試樣空白溶液ABS值(用醋酸緩沖溶液代替酶液)。試驗進行五次，結果取其平均值。
[0023]該試驗結果表明蘆丁 50μΜ、100μΜ、200μΜ對于透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為:43.08%±5.70,56.15%±5.83,65.38%±3.85 ;異槲皮苷 50 μ Μ、100 μ Μ、200 μ M 對于透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為:32.31%±3.44,45.38%±5.01,59.23%±4.39。
[0024]抗氧化實驗
該發(fā)明采用DPPH法測定異槲皮苷的抗氧化功效。
[0025](I)配置DPPH乙醇溶液:稱取1.6mg I, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，溶于10.144mL乙醇溶液，得400 μ M的DPPH乙醇溶液；
(2)樣品吸光度:取ImL異槲皮苷樣品液，加入ImLDPPH乙醇溶液，劇烈震蕩使其混合均勻，將混合液在室溫下避光保存20min，測其在517nm下的吸光度；
(3)空白吸光度:取ImLDMSOjPAImL DPPH乙醇溶液，劇烈震蕩使其混合均勻，將混合液在室溫下避光保存20min，測其在517nm下的吸光度。
[0026]DPPH抑制率=[(空白吸光度-樣品吸光度)/空白吸光度]X 100%
試驗進行五次，結果取其平均值。
[0027]該試驗結果表明蘆丁 50μΜ、100μΜ、200μΜ對于透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為:32.86%±0.83,54.30%±0.67,57.18%±0.38 ;異槲皮苷 50 μ Μ、100 μ Μ、200 μ M 對于透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為:29.31%±1.21,52.10%±0.99,54.15%±1.22。
[0028]以上試驗結果表明，由啤酒花中分離得到的蘆丁、異槲皮苷單體均具有較高的抗過敏、抗氧化活性，因此在醫(yī)藥行業(yè)可用作藥物前體，開發(fā)一系列新型抗過敏、抗氧化藥物，同時也可以應用于食品、化妝品行業(yè)，具有非常廣闊的發(fā)展空間及應用前景。
【主權項】
1.啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于: (1)原料提取:將啤酒花粉碎成粗粉，按照質(zhì)量體積比(kg/L)加入5倍量的冷水，浸泡.12小時，期間超聲提取2次，每次30min，過濾得提取液；共提取2次，合并提取液，濃縮； (2)初步除雜:將濃縮后得到的提取液依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，其中石油醚萃取一次，乙酸乙酯萃取三次；依次除去葉綠素等脂溶性成分、大極性黃酮苷元、小極性的黃酮苷；再用正丁醇對提取液進行萃取，得正丁醇萃取液，減壓濃縮，得正丁醇稠膏； (3)大孔樹脂分離富集:得到的正丁醇稠膏用水溶解，通過XAD-4大孔樹脂柱色譜分離富集，依次用蒸餾水和30%、50%、70%、100%乙醇進行梯度洗脫；收集50%乙醇部分的洗脫液，減壓濃縮，得到洗脫濃縮液； (4)反相柱色譜分離純化:將上述得到的濃縮液通過半制備高效液相色譜儀，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液進行洗脫，得到蘆丁、異槲皮苷單體； (5)抗過敏、抗氧化活性檢測:分別采用了透明質(zhì)酸酶體外抑制法和DPPH法檢測了其抗過敏性和抗氧化活性。
2.如權利要求1所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于步驟(I)中，冷水溫度為5?15°C最佳；浸泡階段，4小時后超聲提取I次，8小時后超聲提取I次，12小時后過濾得提取液；按此方法提取2次，效果最佳。
3.如權利要求1所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于步驟(2)中，可用水飽和的正丁醇對提取液進行萃取；減壓濃縮階段，當正丁醇很難蒸出時，可以加適量水，以形成共沸。
4.如權利要求1所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于步驟(3)中，按柱體積的5% (質(zhì)量分數(shù))上樣，每個梯度洗脫體積為1.5個柱體積。
5.如權利要求1所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于步驟(5)中，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(45:55)進行洗脫，紫外檢測波長為 350nm,流速為 1.0mL/min。
6.如權利要求1所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過敏、抗氧化活性檢測，其特征在于步驟(5)中，透明質(zhì)酸酶溶液濃度為1250 uint/mL, DPPH乙醇溶液濃度為.400 μ M ;抗過敏實驗環(huán)節(jié)，測吸光度時，波長設定為530nm ;抗氧化實驗環(huán)節(jié)，測吸光度時，波長設定為517nm。
【專利摘要】本發(fā)明涉及啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及對其抗過敏、抗氧化活性檢測，有效解決從啤酒花中提取、分離具有高抗過敏性和抗氧化性的蘆丁、異槲皮苷的問題。以啤酒花為原料，采用冷水浸泡、萃取除雜、通過大孔樹脂分離富集，最后用半制備高效液相色譜技術從中分離得到蘆丁、異槲皮苷單體化合物，并采用透明質(zhì)酸酶體外抑制法和DPPH法測定蘆丁、異槲皮苷的抗過敏、抗氧化功效。本發(fā)明方法先進可靠，容易操作，可得到高純度的蘆丁、異槲皮苷單體，經(jīng)檢測均具有很好的抗過敏、抗氧化活性，具有很高的應用價值。
【IPC分類】C07H17-07, C07H1-08, G01N21-31
【公開號】CN104592327
【申請?zhí)枴緾N201310531168
【發(fā)明人】懷其勇, 李陽, 馬慶林
【申請人】山東大學（威海）
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年11月1日